霉菌毒素污染是全球畜牧业和食品工业面临的重大挑战,镰刀菌毒素——玉米赤霉烯酮就是其中的重要一种.来源于粉红螺旋聚孢霉的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase, ZHD)101能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮,但其最适温度为 37-45℃,50℃条件下基本失活,热稳定性需要提高.

玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素,严重危害牲畜以及人类的健康.来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮,然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用.基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导.本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment,MSTA)筛选ZHD的结构灵活区,随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库,得到基于 136 号和 220 号残基的 9 个单点突变设计.结果表明,9 个突变体的热熔融温度(Tm)提高了 0.4?5.6℃,其中S220R和S220W热稳定性表现最好,Tm分别提高了5.6℃和 4.0℃,45℃下的热半失活时间分别延长了 15.4 倍和 3.1 倍,相对酶活分别为野生型的70.6%和 57.3%.分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强,突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了 30.1%和 12.5%,为ZHD热稳定性的提高作出了贡献.这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性,并获得了热稳定性增强的 ZHD变体,为ZHD在工业上的应用打下基础.

[背景]玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是污染最广泛的霉菌毒素之一,对饲料行业和畜牧业造成了巨大的经济损失.目前研究最为广泛的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101因其热稳定性较差,无法满足工业应用上的要求.[目的]为实现玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用,寻找酶学性质更突出的ZEN降解酶.[方法]基于对GenBank数据库的挖掘,发现一个来源于麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiella mackenziei CBS 650.93)的Rmzhd基因,构建pET-46-Rmzhd质粒.利用大肠杆菌表达体系和亲和层析、离子交换纯化体系对蛋白进行表达和纯化,通过高效液相凝胶色谱分析酶学性质.[结果]发现一个新的ZEN水解酶RmZHD,RmZHD在pH 8.6和45℃条件下的活性最高,而且具有较高的耐热性.结构分析表明,较高的盐桥数目和溶剂暴露脯氨酸含量可能是造成其高耐热性的原因.[结论]本研究为促进玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用打下基础.

通过密码子优化、体外多拷贝构建实现玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)降解酶基因(zlhy-6)在毕赤酵母GS115菌株中的高效表达.按酵母密码子偏好性优化zlhy-6基因的密码子,与α因子信号肽编码序列一起合成,插入到pAO815质粒中,通过酶切酶连构建含1-6个表达盒的表达质粒,将其转入毕赤酵母GS115菌中,获得ZEN降解酶重组菌株.重组蛋白分子量为28.9 kDa,与预期一致.重组菌用甲醇诱导3d,蛋白浓度达最高,之后下降;在pH 5.0、4.5条件下诱导培养,表达量最高;每天添加0.8％的甲醇、接种量10％表达水平最高;4拷贝的转化子表达水平最高,三角瓶发酵3d,酶活性达到10 U/mL在lg玉米渣中添加0.1-0.5 mL发酵上清液,水解24 h,玉米渣中ZEN的降解率为44.08％-75.51％.研究结果为ZEN降解酶工业生产及在食品饲料中的应用奠定了基础.

[背景]玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失.利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮.[目的]构建高效表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母系统,以促进玉米赤霉烯酮水解酶的研究和工业应用.[方法]将来源于麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiella mackenziei CBS 650.93)的Rmzhd基因转入毕赤酵母中,筛选获得高效表达菌株,通过高效液相色谱分析发酵液中重组酶的性质.[结果]发酵液中RmZHD对ZEN的酶活力为16.67 U/mL,对α-ZOL的酶活力为9.85 U/mL.SDS-PAGE检测表达产物的分子量,与理论值30.7 kD符合,且发酵上清液蛋白纯度高.RmZHD的最适pH值为9.6,最适温度为45℃,并具有较好的耐热性.[结论]研究结果为玉米赤霉烯酮水解酶的异源表达及其潜在的工业应用提供了一定的指导.

目的:开发一种对α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZOL)催化活性高的水解酶,以促进玉米赤霉烯酮的酶法完全脱毒,推动玉米赤霉烯酮降解酶在饲料业和畜牧业的应用.方法:在NCBI数据库中通过基因挖掘获得一个来源于Exophiala aquamarina CBS 119918的新型玉米赤霉烯酮水解酶EaZHD,基因全长792 bp.构建重组质粒pET46-Eazhd,并在大肠杆菌中成功表达.经Ni-NTA亲和层析和DEAE阴离子交换柱纯化后,利用HPLC测定残余底物浓度的方法来表征其酶学性质.结果:EaZHD对玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的酶活力为0.764 U/mg,而对α-ZOL的酶活力为1.529 U/mg,是对底物ZEN降解活力的2倍.EaZHD在pH 8.6和温度40℃条件下的活性最高,并具有较好的热稳定性和碱性条件下较高的pH稳定性.通过对EaZHD活性中心附近的氨基酸进行突变和活性分析,确定了对催化活性起关键作用的三个氨基酸,以及对底物特异性有影响的两个关键氨基酸.结论:为推动饲料业和畜牧业中玉米赤霉烯酮的酶法脱毒奠定了基础.

来源于粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea的玉米赤霉烯酮水解酶(ZHD101)可以有效降解谷物农副产品和饲料中的霉菌毒素玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN),但是,该酶的热稳定性较低,限制了其在工业中的应用.由于水解ZEN的反应没有吸光值的变化,不适合高通量筛选.本文以ZHD101为模式酶,进行计算虚拟突变并结合实验验证.通过比对不同温度下的分子动力学模拟轨迹,选取32个柔性位点;再通过位置特异性评分和酶构象自由能计算,从32个柔性位点上的608个虚拟饱和突变体中筛选出12个突变体.经实验验证,其中3个突变体N156F、S194T和T259F的热熔融温度有一定程度的提升(△Tm＞4℃),且酶活性与野生型类似甚至更高(相对酶活性为95.8％、131.6％和169.0％).分子动力学模拟分析显示,导致3个突变体热稳定性提高的可能作用机理分别为NH-π作用力、盐桥重排和分子表面空穴填充.将3个突变体进行迭代组合突变,N 156F/S 194T表现出最高的热稳定性(△Tm=6.7℃).这项工作表明基于柔性区域的虚拟饱和突变在酶稳定性改造上的可行性,探索计算虚拟改造结合实验验证的酶改造策略.

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一种雌激素类真菌毒素,可以与动物的雌激素受体竞争性结合,导致动物生殖系统内的激素紊乱.ZEN内酯水解酶(ZEN lactone hydrolase,ZHD)可以水解ZEN中的内酯键,进而使其转化为无雌激素毒性的产物.[目的]利用生物信息学分析以及酶学性质探索,鉴定出一个具有新特性的ZEN内酯水解酶.[方法]构建pET28a-zhdlif表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达ZHD11F,利用Ni-NTA纯化得到ZHD11F,对其酶学性质进行分析,并通过结构模拟和分子动力学分析阐明ZHD11F低温活性的机制.[结果]ZHD11F以ZEN为底物,比酶活为40.04 U/mg,最适反应温度与pH值分别为35℃和8.0,在pH 6.0-9.5的范围内具有超过60％的酶活力,在35℃以下具有较好的热稳定性,能够耐受多种金属离子.ZHD11F在10℃和20℃时,其活性分别保持20％和40％.更多的loop区增加了结构的柔韧性是该酶稳定性较差、在低温活性比较高的主要原因.[结论]Phialophora attae是瓶霉属的一种真菌,目前此真菌来源的酶极少被鉴定.关于本研究将Phialophora attae来源的ZEN内酯水解酶ZHD11F,在大肠杆菌中成功可溶性表达并得到纯酶,表征分析显示该酶是目前报道的第一个低温ZEN内酯水解酶,为研究此类酶的耐冷机制、广温度范围提供了候选,同时拓展了Phialophora attae来源酶的功能研究.