目的 比较白喉无毒突变体(cross-reactive material 197,CRM197)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)结合疫苗在小鼠体内的免疫原性.方法 在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的缩合作用下,将TT和DT用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备TT-AH及DT-AH衍生物,GCMP再分别与TT-AH、DT-AH及CRM197共价结合制备结合物,经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化后,进行化学检测、相对分子质量测定及鉴别试验.用GCMP及3种结合物经皮下注射NIH小鼠,第0、14、28天各免疫1次,分别于首免后第7、21和35天经小鼠颈动脉采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价.结果 GCMP-TT和GCMP-DT的糖/蛋白比及多糖回收率较高,GCMP-CRM197较低,3种结合物游离多糖的含量均在5％以下,相对分子质量分别为5.8× 106、2.8× 106、1.1×106,且均可与GCMP的诊断血清产生沉淀线.3种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,抗体水平均明显高于多糖组(P＜0.05);免疫2针后,GCMP-TT与GCMP-DT组的抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05),而GCMP-TT和GCMP-DT组的抗体水平明显高于GCMP-CRM197组(P＜O.05);免疫3针后,GCMP-TT组小鼠产生抗体水平明显高于GCMP-DT及GCMP-CRM197组(P＜0.05).结论 3种不同载体的GCMP结合物免疫小鼠后均可产生良好的免疫应答,对于共价结合的方法,载体蛋白TT优于其他两种载体.

目的 构建一种新型的重组蛋白大肠杆菌胞内自动切割表达系统表达可溶性的CRM197重组蛋白,实现一步法纯化.方法 将CRM197编码序列与硫氧还蛋白(Trx)序列融合并克隆于原核表达载体pET-32a(+)载体上, Trx与CRM197之间加入HRV3C(人鼻病毒3C)蛋白酶识别区序列和组氨酸纯化标签编码序列,HRV3C蛋白酶基因克隆于原核表达质粒pGArasd,共同转化大肠杆菌Origami B (DE3),15 ℃温和诱导,并使用Ni-NTA基质亲和纯化CRM197重组蛋白.结果 CRM197融合蛋白表达后,随即被伴随表达的HRV3C蛋白酶水解释放出游离的带His标签的CRM197重组蛋白,经过一步法亲和纯化,得到纯度约95%的CRM197样品.与DNA共同孵育,显示所获CRM197重组蛋白具有脱氧核糖核酸酶活性.结论 通过构建新型的双质粒自动切割原核表达系统,简化了在大肠杆菌表达纯化可溶性CRM197重组蛋白的工艺,降低了制备成本.

CRM197 (Cross-reacting material 197)是白喉毒素的无毒突变体,在生物制药领域具有非常广泛的应用前景.为了实现 CRM197 在大肠杆菌中的无标签、可溶表达,以替代现有昂贵、复杂的白喉杆菌分泌发酵工艺,文中对目的蛋白的序列进行优化,转化大肠杆菌经IPTG诱导,目的蛋白获得了可溶性高表达,目的蛋白约占碎菌上清总蛋白的40％.超声破菌后、经阴离子交换、肝素亲和以及脱盐三步柱上层析获得纯度高于95％的CRM197样品.细胞毒性实验证明,CRM197的IC50值是白喉毒素IC50值的2.1×107倍,是白喉类毒素IC50值的9.6倍,表明文中表达的CRM197是安全无毒的.随后,比较了高、低剂量的CRM197在小鼠体内的免疫原性,发现2 μg组三免后的抗体滴度与20 μg组的相当,可达1:409 600.文中建立了CRM197的无标签、高效、可溶表达的大肠杆菌表达系和快速纯化体系,获得了具有较好免疫原性和安全性的重组蛋白,为该蛋白的进一步应用奠定了基础.

目的 对本公司制备的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白进行结构确证分析.方法 通过发酵、提纯制备3批CRM197蛋白,经N-末端序列、C-末端序列、质量肽图和肽段覆盖率分析进行一级氨基酸序列结构确证分析,经圆二色谱法进行二级蛋白结构确证分析.结果 3批CRM 197蛋白N-末端均为GADDVVDSSK,C-末端均为FEIKS,质量肽图的紫外图谱高度一致,肽段覆盖率为100％,一级结构与标准CRM197蛋白氨基酸序列完全一致.3批CRM197蛋白二级结构测算值比例差异不大,批间稳定.结论 本公司自制的3批CRM197蛋白与标准CRM197蛋白结构基本一致,为研制以CRM197为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗及其产业化生产奠定了基础.

为了获得有活性的白喉毒素突变体蛋白(Cross-reacting material 197,CRM197),本研究利用分子伴侣pG-KJE8与重组质粒pET28a-CRM197在大肠杆菌原核表达系统中进行共表达,来促进目的 蛋白的正确折叠,进而提高CRM197蛋白的可溶性表达.将质粒转化至大肠杆菌后并诱导其表达目的 蛋白,再通过SDS-PAGE胶染色、Western blotting等技术对所得蛋白进行检测分析.结果 发现:利用体外重组技术成功得到了pET28a-CRM197重组蛋白原核表达质粒,且CRM 197重组蛋白在原核表达系统中主要以包涵体形式表达;通过探索和优化,确定了诱导蛋白的最佳浓度和温度,当加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG、0.5 mg/mL L-阿拉伯糖、5.0 ng/mL四环素,在20℃条件下诱导16h时,目的 蛋白的可溶性表达得到显著提高;可溶性表达的CRM197重组蛋白可以与CRM197一抗发生特异性结合,免疫反应性良好.因此,研究发现分子伴侣pG-KJE8可以促进CRM197重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,且能很好地与CRM 197一抗发生特异性结合,证实CRM 197重组蛋白具有良好的免疫反应性,为CRM 197蛋白的工业化生产及应用奠定了一定的基础.

多糖蛋白结合疫苗的研发及成功上市是预防细菌性传染病(bacterial infectious diseases)的突破,目前已批准上市的多糖蛋白结合疫苗主要有b型流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌结合疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗.载体蛋白的选择是多糖蛋白结合疫苗的免疫原性增强的关键因素,目前获批上市的疫苗主要使用的载体蛋白有破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)和白喉毒素突变体(CRM197)、不可分型流感嗜血杆菌(non-typeable Haemophilus influenzae,NTHi)蛋白 D 以及重组铜绿假单胞菌菌外毒素 A(recombinant exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa,rEPA)等.与此同时,多价疫苗的研发以及多种疫苗联合接种已成为当前细菌性疫苗发展的方向,但不同载体蛋白的结合疫苗同时接种可能引起免疫干扰.现对多价疫苗和联合疫苗接种时其相关的免疫应答影响作一概述,旨在为今后多糖蛋白结合疫苗的研发方向以及相关接种程序提供借鉴或启示.

白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)所产生的外毒素,具有极强的细胞毒性.而交叉反应物质197(cross-reacting material 197,CRM197)是DT无毒突变体.CRM197通过氨基酸突变导致其丧失细胞毒性,目前在感染性疾病的预防用疫苗开发、非感染性疾病的治疗用疫苗开发、癌症治疗等领域得到了广泛尝试和运用.现就CRM197的分子基础、异源表达以及应用现状作一概述.

目的 基于紫外分光光度法,建立一种测定白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白含量的方法.方法 在天然折叠状态和非折叠状态(CRM197蛋白经盐酸胍变性)下,分别测定相同含量的CRM197蛋白A280nm值,再根据朗伯-比尔定律c=A/εL计算其折叠状态消光系数.同时,使用当前建立的方法与BCA法分别测定CRM197蛋白的含量,并对2种方法的差异和检测特点进行比较分析.结果 根据CRM197蛋白的氨基酸一级序列与相对分子质量计算出其理论消光系数为0.934 mL/(mg·cm),在280 nm处的实验消光系数为(0.959±0.006)mL/(mg·cm).2种方法测定同一蛋白样本的结果一致,分别为(2.17±0.02)mg/mL和(2.14±0.09)mg/mL;本方法检测值的Cv为0.70％,BCA法检测值的CV为4.15％.结论 本研究建立的CRM197蛋白含量测定方法准确性高、线性范围宽、获取数据快,可用于CRM197蛋白含量的测定,同时为其他载体蛋白的含量测定提供了参考.

目的 建立反相高效液相色谱法(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度.方法 利用Agilent AdvanceBio RP-mAb SB-C8(100 mm×2.1 mm)分析柱和Agilent1260高效液相色谱系统,以含0.1％三氟乙酸水溶液-异丙醇(98∶2)为流动相A,以含0.1％三氟乙酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱,体积流速为0.5 mL/min,检测波长为280 nm,柱温为65℃,进样体积为10 μL,采用面积归一法检测CRM197蛋白纯度,并对方法的适用性、专属性、重复性、中间精密度、线性、灵敏度和耐用性指标进行考察.用建立的方法检测CRM197蛋白酸处理供试品溶液、碱处理供试品溶液及3批原液的纯度.结果 建立的方法系统适用性良好;专属性验证表明空白溶液在目标峰积分范围内无干扰峰,热处理CRM197蛋白目标峰与其他杂质峰分离度＞1.5;6次重复进样目标峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.14％,保留时间RSD为0.81％;中间精密度分析目标峰面积RSD为1.62％,保留时间RSD为0.06％;CRM197蛋白含量在20～2 000 μg/mL范围内,与峰面积存在良好的线性关系(R2=0.999 8);最低检测限为10 μg/mL,定量限为20 μg/mL;在改变柱温色谱条件时,目标峰面积百分比与保留时间均RSD≤5.00％,耐用性研究合格.对酸处理、碱处理供试品溶液及3批原液进行纯度检测,纯度在76.5％～96.9％,结果准确.结论 建立的RP-HPLC检测CRM197蛋白纯度的方法,经验证各项指标均符合要求,可用于CRM197蛋白的纯度检测.