目的 比较白喉无毒突变体(cross-reactive material 197,CRM197)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)结合疫苗在小鼠体内的免疫原性.方法 在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的缩合作用下,将TT和DT用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备TT-AH及DT-AH衍生物,GCMP再分别与TT-AH、DT-AH及CRM197共价结合制备结合物,经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化后,进行化学检测、相对分子质量测定及鉴别试验.用GCMP及3种结合物经皮下注射NIH小鼠,第0、14、28天各免疫1次,分别于首免后第7、21和35天经小鼠颈动脉采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价.结果 GCMP-TT和GCMP-DT的糖/蛋白比及多糖回收率较高,GCMP-CRM197较低,3种结合物游离多糖的含量均在5％以下,相对分子质量分别为5.8× 106、2.8× 106、1.1×106,且均可与GCMP的诊断血清产生沉淀线.3种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,抗体水平均明显高于多糖组(P＜0.05);免疫2针后,GCMP-TT与GCMP-DT组的抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05),而GCMP-TT和GCMP-DT组的抗体水平明显高于GCMP-CRM197组(P＜O.05);免疫3针后,GCMP-TT组小鼠产生抗体水平明显高于GCMP-DT及GCMP-CRM197组(P＜0.05).结论 3种不同载体的GCMP结合物免疫小鼠后均可产生良好的免疫应答,对于共价结合的方法,载体蛋白TT优于其他两种载体.

CRM197 (Cross-reacting material 197)是白喉毒素的无毒突变体,在生物制药领域具有非常广泛的应用前景.为了实现 CRM197 在大肠杆菌中的无标签、可溶表达,以替代现有昂贵、复杂的白喉杆菌分泌发酵工艺,文中对目的蛋白的序列进行优化,转化大肠杆菌经IPTG诱导,目的蛋白获得了可溶性高表达,目的蛋白约占碎菌上清总蛋白的40％.超声破菌后、经阴离子交换、肝素亲和以及脱盐三步柱上层析获得纯度高于95％的CRM197样品.细胞毒性实验证明,CRM197的IC50值是白喉毒素IC50值的2.1×107倍,是白喉类毒素IC50值的9.6倍,表明文中表达的CRM197是安全无毒的.随后,比较了高、低剂量的CRM197在小鼠体内的免疫原性,发现2 μg组三免后的抗体滴度与20 μg组的相当,可达1:409 600.文中建立了CRM197的无标签、高效、可溶表达的大肠杆菌表达系和快速纯化体系,获得了具有较好免疫原性和安全性的重组蛋白,为该蛋白的进一步应用奠定了基础.

目的:研制5型肺炎链球菌荚膜多糖(PN5PS)与白喉无毒突变体(CRM197)结合疫苗.方法:采用还原胺化法制备结合物,即以肺炎5型多糖的邻位羟基作为活化位点,用高碘酸钠进行氧化,形成的醛基与CRM197蛋白上的氨基生成席夫碱反应,在氰基硼氢化钠的作用下形成共价结合物,并将制备的结合物与两种不同铝佐剂吸附,用间接ELISA法检测大鼠血清中针对肺炎5型多糖的抗体效价,比较结合疫苗与不同佐剂吸附前后的免疫原性.结果:当多糖活化度为7.3时,总糖及蛋白的回收率较高,游离糖含量较低,糖蛋白结合比在1.2～2.7时结合疫苗具有较强的免疫原性,结合比为1.9时结合疫苗的免疫原性最强;结合物吸附磷酸铝佐剂后所产生的抗体水平略高于氢氧化铝.结论:通过还原胺化法制备的PN5PS-CRM197结合疫苗具有较好的免疫原性.

目的 对本公司制备的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白进行结构确证分析.方法 通过发酵、提纯制备3批CRM197蛋白,经N-末端序列、C-末端序列、质量肽图和肽段覆盖率分析进行一级氨基酸序列结构确证分析,经圆二色谱法进行二级蛋白结构确证分析.结果 3批CRM 197蛋白N-末端均为GADDVVDSSK,C-末端均为FEIKS,质量肽图的紫外图谱高度一致,肽段覆盖率为100％,一级结构与标准CRM197蛋白氨基酸序列完全一致.3批CRM197蛋白二级结构测算值比例差异不大,批间稳定.结论 本公司自制的3批CRM197蛋白与标准CRM197蛋白结构基本一致,为研制以CRM197为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗及其产业化生产奠定了基础.

为了获得有活性的白喉毒素突变体蛋白(Cross-reacting material 197,CRM197),本研究利用分子伴侣pG-KJE8与重组质粒pET28a-CRM197在大肠杆菌原核表达系统中进行共表达,来促进目的 蛋白的正确折叠,进而提高CRM197蛋白的可溶性表达.将质粒转化至大肠杆菌后并诱导其表达目的 蛋白,再通过SDS-PAGE胶染色、Western blotting等技术对所得蛋白进行检测分析.结果 发现:利用体外重组技术成功得到了pET28a-CRM197重组蛋白原核表达质粒,且CRM 197重组蛋白在原核表达系统中主要以包涵体形式表达;通过探索和优化,确定了诱导蛋白的最佳浓度和温度,当加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG、0.5 mg/mL L-阿拉伯糖、5.0 ng/mL四环素,在20℃条件下诱导16h时,目的 蛋白的可溶性表达得到显著提高;可溶性表达的CRM197重组蛋白可以与CRM197一抗发生特异性结合,免疫反应性良好.因此,研究发现分子伴侣pG-KJE8可以促进CRM197重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,且能很好地与CRM 197一抗发生特异性结合,证实CRM 197重组蛋白具有良好的免疫反应性,为CRM 197蛋白的工业化生产及应用奠定了一定的基础.

白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)所产生的外毒素,具有极强的细胞毒性.而交叉反应物质197(cross-reacting material 197,CRM197)是DT无毒突变体.CRM197通过氨基酸突变导致其丧失细胞毒性,目前在感染性疾病的预防用疫苗开发、非感染性疾病的治疗用疫苗开发、癌症治疗等领域得到了广泛尝试和运用.现就CRM197的分子基础、异源表达以及应用现状作一概述.

目的 基于紫外分光光度法,建立一种测定白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白含量的方法.方法 在天然折叠状态和非折叠状态(CRM197蛋白经盐酸胍变性)下,分别测定相同含量的CRM197蛋白A280nm值,再根据朗伯-比尔定律c=A/εL计算其折叠状态消光系数.同时,使用当前建立的方法与BCA法分别测定CRM197蛋白的含量,并对2种方法的差异和检测特点进行比较分析.结果 根据CRM197蛋白的氨基酸一级序列与相对分子质量计算出其理论消光系数为0.934 mL/(mg·cm),在280 nm处的实验消光系数为(0.959±0.006)mL/(mg·cm).2种方法测定同一蛋白样本的结果一致,分别为(2.17±0.02)mg/mL和(2.14±0.09)mg/mL;本方法检测值的Cv为0.70％,BCA法检测值的CV为4.15％.结论 本研究建立的CRM197蛋白含量测定方法准确性高、线性范围宽、获取数据快,可用于CRM197蛋白含量的测定,同时为其他载体蛋白的含量测定提供了参考.

目的 建立反相高效液相色谱法(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度.方法 利用Agilent AdvanceBio RP-mAb SB-C8(100 mm×2.1 mm)分析柱和Agilent1260高效液相色谱系统,以含0.1％三氟乙酸水溶液-异丙醇(98∶2)为流动相A,以含0.1％三氟乙酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱,体积流速为0.5 mL/min,检测波长为280 nm,柱温为65℃,进样体积为10 μL,采用面积归一法检测CRM197蛋白纯度,并对方法的适用性、专属性、重复性、中间精密度、线性、灵敏度和耐用性指标进行考察.用建立的方法检测CRM197蛋白酸处理供试品溶液、碱处理供试品溶液及3批原液的纯度.结果 建立的方法系统适用性良好;专属性验证表明空白溶液在目标峰积分范围内无干扰峰,热处理CRM197蛋白目标峰与其他杂质峰分离度＞1.5;6次重复进样目标峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.14％,保留时间RSD为0.81％;中间精密度分析目标峰面积RSD为1.62％,保留时间RSD为0.06％;CRM197蛋白含量在20～2 000 μg/mL范围内,与峰面积存在良好的线性关系(R2=0.999 8);最低检测限为10 μg/mL,定量限为20 μg/mL;在改变柱温色谱条件时,目标峰面积百分比与保留时间均RSD≤5.00％,耐用性研究合格.对酸处理、碱处理供试品溶液及3批原液进行纯度检测,纯度在76.5％～96.9％,结果准确.结论 建立的RP-HPLC检测CRM197蛋白纯度的方法,经验证各项指标均符合要求,可用于CRM197蛋白的纯度检测.