目的 建立基于紫外可见光谱检测抗体偶联药物(ADC)药物-抗体偶联比(DAR)的检测方法并进行验证.方法 使用盐酸胍作为变性剂,修正基于氨基酸组成推算的抗体在 280 nm 处消光系数.利用比尔-朗伯定律测定抗体和小分子药物在 252 nm 处的消光系数及小分子药物在280 nm 处的消光系数.确定基于紫外可见光谱检测 ADC的 DAR 公式参数和检测方法.根据《中华人民共和国药典》(2020)指导原则,对方法进行验证.结果 抗体在 252 nm 和 280 nm 处的摩尔消光系数分别为 91258 和 228913 L/(mol·cm);tubulysin 衍生物小分子药物在 252 和 280 nm 处的摩尔消光系数分别为 12798和 3186 L/(mol·cm).DAR =(A280-ADC×91258-A252-ADC×228913)/(A252-ADC×3186-A280-ADC×12798).方法 专属性符合要求.模拟 DAR 值为 1.881～15.045 的 ADC 药物进行准确性验证,回收率为 79.38%～99.13%.重复性相对标准偏差(RSD%)为 1.93%,中间精密度 RSD%为2.36%.以 252 nm 处吸光值与 280 nm 处吸光值的比值为纵坐标,以模拟 DAR 值为横坐标进行线性回归的方程为y = 0.0408x + 0.414,相关系数 r2 为 0.9954.根据 DAR 测定公式推算该方法的检测范围为 0.60～82.56.不同检测波长[(280±1)或(252±1)nm]、不同放置时间(0～60 min)、不同批次的比色皿条件下,DAR 值检测结果的 RSD%均<5.0%.结论 基于紫外可见光谱法进行抗体偶联药物 DAR 测定的方法简单、可操作性强,专属性、准确度、精密度、耐用性满足检测需求,该方法可以用于抗体偶联药物的质量分析和质量控制.

比较不同干燥方法对黑果枸杞的外观性状、口感、活性成分含量及其抗氧化活性的影响,指导黑果枸杞生产实践.分别将冷冻干燥、低温干燥和自然烘干的黑果枸杞用福林酚比色法、紫外分光光度法、消光系数法和DPPH法、FRAP法测定总多酚、原花青素、花色苷含量及抗氧化活性.结果表明,干燥方法对黑果枸杞的性状、口感、活性成分含量及抗氧化活性均产生一定程度影响.冷冻干燥后黑果枸杞外观性状及口感均佳,水分含量低,总多酚、原花青素、花色苷含量低于自然晾干者,但其清除DPPH自由基能力最强;自然晾干者外观形状及口感较差,水分含量高,但其3种活性成分含量最高,FRAP法测得的抗氧化活性最强.因此应综合考虑性状、口感、抗氧化活性及生产成本选择黑果枸杞的干燥方法.

目的 建立单克隆抗体药物消光系数测定方法,用于单克隆抗体药物的鉴别和紫外分光光度法的定量分析,并对其进行初步评价.方法 使用6 mol/L盐酸胍对抗体进行变性处理,打开抗体折叠的高级结构,将其当作是色氨酸、酪氨酸和“S-S”键的三元体系,通过检测相同浓度下折叠和非折叠抗体在紫外280 nm波长处的吸光值,计算抗体的消光系数,并进行方法的精密度验证.结果 两种单克隆抗体mAb1和mAb2在280 nm波长处的消光系数平均值分别为1.702和1.387 mL/(mg·cm);两位实验员检测的消光系数各自相对标准偏差分别为0.48％和0.87％,总相对标准偏差为0.69％,均小于1％,表明方法精密度良好.结论 建立的方法操作简单,不依赖于抗体浓度,不破坏其二硫键结构,结果准确,可用于单克隆抗体药物消光系数的测定.

目的 研究黄杞苷保护DNA氧化损伤的活性与可能机制.方法 采用DNA保护分析法、超氧自由基(·O2-)清除法、Ferrozine显色法,探讨其保护DNA氧化损伤的活性与可能机制,并通过紫外可见光谱(UV-vis spectra)-察其与Fe2+络合的变化.结果 在DNA保护分析法、·O2-自由基清除法、Ferrozine显色法中,黄杞苷在一定浓度范围内,表现出浓度依赖性.其IC50值分别(60.3±9.9),(44.5±7.6),(159.7±19.9)μg·mL-1.UV-vis光谱分析表明,黄杞苷与Fe2+混合后,在波长475 nm处出现新的峰,摩尔消光系数为102.5 L·mol-1·cm-1、结论 黄杞苷能较好地保护DNA,免受羟基自由基(·OH)诱导的氧化损伤 其保护作用由直接清除ROS和间接清除ROS 2个途径实现.黄杞苷直接清除ROS,可能与氢转移和电子转移有关;间接清除ROS可能通过络合Fe2+的方式,阻断·OH自由基生成.不过,受3-位鼠李糖基的空间位阻影响,其Fe2+络合能力较弱.

目的 应用生物信息学软件预测结核分枝杆菌Rv1195基因编码蛋白PE13的结构和功能. 方法 利用在线分析软件ProtParam,ProtScale,SOSUI,TMHMM Server v.2.0,SignalP 4.1,Motif Scan,TargetP 1.1 Server,WoLF PSORT,SOPMA,SWISS-MODEL,BepiPred 1.0 Server,SYFPEITHI和STRING数据库分析预测结核分枝杆菌Rv1195基因编码蛋白PE13的理化性质、亲疏水性、可溶性、跨膜区、信号肽、翻泽后修饰位点、亚细胞定位、二级结构、三级结构、B细胞、T细胞抗原表位以及蛋白质的相互作用. 结果 PE13蛋白由99个氨基酸组成,分子式为C418H655N113O139S4,相对分子质量(Mr)为9.615 71×103,理论等电点为4.56,280 m波长处消光系数为4 470,吸光度(Abs)为0.465,不稳定性系数为41.93,脂溶性系数为82.42,总平均亲水性系数为0.593,预测该蛋白为不稳定疏水性蛋白;该蛋白无跨膜区和信号肽,亚细胞定位预测其可能为分泌蛋白;二级结构中以α-螺旋为主,占86.87％,β-折叠和无规则卷曲分别占2.02％和11.11％,无β-转角,有1个蛋白激酶C磷酸化位点,3个B细胞抗原表位,5个限制性CTL细胞抗原表位,2个限制性Th细胞抗原表位;预测PE13蛋白与PPE18及esxK有相互作用. 结论 生物信息学预测PE13蛋白含有多个潜在的抗原表位,可作为研发新的结核病疫苗靶标.

背景:EgA31蛋白是参与成虫吸盘肌收缩的一类蛋白,是细粒棘球蚴绦虫保护性免疫中重要的候选疫苗分子.目的:应用生物信息学方法对细粒棘球绦虫EgA31蛋白进行分析,预测其可能的T细胞及B细胞优势抗原表位.方法:从GenBank中获取EgA31蛋白的氨基酸序列(GenBank登记号为AAC21558.1),利用ProtParam在线程序分析EgA31蛋白的分子质量、理论等电点、氨基酸组成、原子组成、消光系数、不稳定系数和总平均疏水性,DNAstar Protein模块、SOPMA在线服务器分析蛋白二级结构,Phyre的同源建模服务器预测其蛋白质三级结构,最后通过ABCpred、BepiPred、SYFPEITHI、IDBE等软件联合预测细粒棘球绦虫EGA31蛋白的T细胞及B细胞的优势抗原表位.结果与结论:①EgA31蛋白由601个氨基酸组成,其中含有112个强碱性氨基酸,121个强酸性氨基酸,归类为不稳定且亲水性蛋白;②在线分析发现,EgA31蛋白的二级结构中α-螺旋约占82.36％,延长链约占4.16％,β-转角约占3.16％,无规则卷曲约占10.32％;③通过ABCpred、BepiPred、SYFPEITHI、IDBE等软件联合分析后预测了4段优势T细胞抗原、6段优势B细胞抗原以及1段T-B细胞联合表位;④生物学信息方法能较为全面地预测细粒棘球绦虫EgA31蛋白的优势T细胞及B细胞抗原表位,为进一步研制疫苗和检测试剂奠定了基础.

目的:对铁棍山药蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)基因的编码区域(coding sequence,CDS)进行克隆和蛋白质结构分析,为该基因的调控机制与山药多糖的合成机制提供理论依据.方法:提取铁棍山药总RNA并反转录为cDNA第一链,根据本实验室铁棍山药基因组数据经注释得到的SUS基因序列设计一对特异性引物,利用基因克隆技术获得SUS基因的编码区域并通过蛋白质预测分析软件分析蛋白质序列特征.结果:克隆得到一个长度2 448 bp的基因序列,具有一个完整的开放阅读框架(open reading frame,ORF),命名为DoSUS1.DoSUS1的分子式为C4209 H6534N1115O1205S23,相对分子质量9 788.32,共815个氨基酸,理论等电点(PI)6.10,消光系数为110 505,脂溶性指数(AI)为94.15,不稳定指数为32.18,平均亲水指数(GRAVY)为-0.225,属于稳定可溶性酸性蛋白质.DoSUS1氨基酸序列存在多个磷酸化位点,不存在跨膜区与信号肽.蛋白质二级结构与三级结构结果显示DoSUS1属于全α类蛋白质.功能域预测结果显示DoS US1有蔗糖合成与糖基转移两个功能域.同源性比对结果显示DoSUS1的氨基酸序列与所比对单子叶植物的氨基酸序列相似性均＞80％.系统进化树显示DoSUS1与单子叶植物的SUS进化关系较近.结论:首次从铁棍山药中克隆出SUS基因的编码序列,并对其蛋白质结构进行了分析,为进一步阐明SUS在山药生长发育和多糖合成机制中的作用奠定了基础.

为探究青海高寒山区典型林分冠层结构与林内光环境中维持林下植被物种多样性稳定的关键因素,该研究以青海大通县青海云杉林(Ⅰ)、青杨林(Ⅱ)、华北落叶松-青海云杉混交林(Ⅲ)、青杨-白桦混交林(Ⅳ)和白桦-青海云杉混交林(Ⅴ)5种典型人工林分为研究对象,运用冠层分析仪采集数据,并结合实地调查,研究冠层结构与林内光环境特征及其对林下植被的影响.结果表明:(1)林分Ⅰ、Ⅲ的林冠开度显著低于林分Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ (P＜0.05),各林分叶面积指数大小顺序为Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅴ＞Ⅳ,总体表现为阔叶林的林冠开度大于针叶林,但其叶面积指数小于针叶林;林分Ⅱ、Ⅳ的直射辐射、散射辐射及总辐射均显著高于林分Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ (P＜0.05),其中林下总辐射与散射辐射表现为Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅴ＞Ⅰ＞Ⅲ,直射辐射为Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅴ;林分Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的消光系数均显著高于Ⅰ、Ⅲ,总体上均表现为阔叶林＞针叶林.(2)相关分析结果表明,林冠开度与林下光照指标呈极显著正相关关系(P＜0.01),叶面积指数与林下光照指标呈极显著负相关关系(P＜0.01),且其对林下散射辐射的控制能力最强;典型相关分析表明,纯林的林冠开度对冠层结构的贡献和解释能力较叶面积指数和平均叶倾角大,混交林的叶面积指数对林下光照的影响大于纯林.(3)混交林的林下物种多样性指数(H)及丰富度指数(P)均高于纯林;林下草本层物种多样性指数(H)及丰富度指数(P)与林冠开度及林下光辐射呈显著正相关关系,与叶面积指数呈显著负相关关系(P＜0.05);物种均匀度(Jsw)与平均叶倾角呈极显著负相关关系(P＜0.01),与林下散射辐射呈显著正相关关系(P＜0.05).研究认为,在人工纯林改造和结构调整中,对乔木层适当补植伴生树种,并逐步调整为多树种混交林,增加冠层结构和林下光照异质性,将更有利于林下植被物种多样性的维持.

采用PCR技术从鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120中扩增获得红色荧光蛋白基因aⅡ1280 gaf2,并利用BamH Ⅰ和SalⅠ酶切位点,将该基因插入到pET-30a(+)中,构建表达载体pET-aⅡ1280gaf2.将该表达载体与藻胆色素生物合成质粒pACYC-ho 1-pcyA同时转化到大肠杆菌E.coli BL21 (DE3),表达后获得大肠杆菌色素细胞.结果 显示,该色素细胞在荧光显微镜下具有红色荧光,且在15E/15Z态之间具有可逆光效应.进一步以pET-aⅡ1280 gaf2为模板,通过定点突变技术在aⅡ1280 gaf2基因中引入C53A突变,获得了突变体AⅡ1280 GAF2 (C53A).将AⅡ1280 GAF2 (C53A)与藻胆色素在E.coli BL21 (DE3)中共表达,获得了比野生型红色荧光更强的大肠杆菌色素细胞.研究结果表明,与野生型相比,AⅡ1280 GAF2 (C53A)具有较高的摩尔消光系数和荧光量子产率,红色荧光更强.

基于NCBI数据库,对文蛤过氧化氢酶基因(MmeCAT)进行生物信息学分析,旨在为文蛤过氧化氢酶的结构与功能的研究提供理论基础.结果表明,该基因编码511个氨基酸.文蛤过氧化氢酶分子量为58181.29 Da,分子式为C2588 H3928 O767 N730 S20,理论等电点为8.05,属亲水蛋白.带负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为63个,带正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)为65个.假设所有半胱氨酸全部形成胱氨酸,其消光系数为63175 mol/L,相应的吸光度为1.086;假设所有的半胱氨酸均未形成胱氨酸时,消光系数为62800 mol/L,相应的吸光度为1.079;其半衰期为30 h,脂肪族氨基酸指数为57.28,不稳定系数为27.77(<40),可知文蛤过氧化氢酶为稳定蛋白质.亚细胞定位于过氧化物酶体,存在71个磷酸化位点和51个糖基化位点,无信号肽.二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,在物种进化上具有高度的保守性保守结构域预测表明,该基因编码蛋白可能属于典型单功能过氧化氢酶的第三分支.研究文蛤过氧化氢酶结构,能够为文蛤抗逆性品种选育提供理论基础.