LIS1蛋白是一种与人类无脑回疾病以及细胞癌变相关的重要蛋白.对盘基网柄菌DdLIS1进行生物信息学分析,探究盘基网柄菌能否作为研究人类无脑回疾病及细胞癌变机制的模型.现从NCBI中的Genank找到盘基网柄菌DdLIS1的氨基酸序列,随后进行blastp找到模式生物中相似序列,利用理化性分析网站ProtScale、ProtParam分析DdLISl的理化性质,通过NCBI中的保守结构域库(CDD)分析DdLIS1的保守结构域,使用MEGA6.0并选用邻位连接法构建系统进化树,分别使用PredictProtein、SWISS-MODEL网站预测DdLIS1蛋白的二级结构、三维结构.结果得出DdLIS1蛋白全长为419,属于亲水性蛋白,有7个保守结构域,属于WD40家族,与人类和小鼠的氨基酸序列相似性为72％.二级结构中β折叠所占比例最高,为49.40％,α螺旋、随机卷曲分别占该蛋白7.16％、43.44％,与三级结构一致.以上结果说明DdLISl与LIS1高度相似,有助于盘基网柄菌能够作为研究人类无脑回疾病以及细胞癌变机制的模型.

早衰蛋白(presenilin,PS)是γy分泌酶的组成成分,其突变可造成阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)的形成.因PS所造成AD的发病机理较复杂,因而我们想探究一下模式生物盘基网柄菌(Dictyos telium discoideum)是否能够作为研究早衰蛋白的模型.从NCBI网站中得到盘基网柄菌早衰蛋白DdPsenA和DdPsenB氨基酸序列,随后利用ProtScale、ProtParam理化性分析工具、保守结构域、TMHMM2跨膜区分析网站、进化树软件MEGA6.0、二级结构PredictProtein以及三级结构SWISS-Model服务器对上述蛋白进行生物信息学分析.DdPsenA的氨基酸长度为622,是亲水性蛋白,其相对分子质量为69 502.79,等电点为4.53.DdPsenB的氨基酸长度为473,属于疏水性蛋白,其相对分子质量为52 558.74,等电点为4.49,与DdPsenA同属于Peptidase_A22B超家族.跨膜分析出DdPsenA和DdPsenB均有8个跨膜区.DdPsenA与人类presenilin-2序列相似性为67％,DdPsenB与人类presenilin-1序列相似性分别为60％.盘基网柄菌可以作为研究早衰蛋白功能和作用机制的模型.

J-1基因的突变或缺失导致帕金森病相关症状,但其在帕金森病中的作用以及其亚细胞位置尚存在争议.盘基网柄菌是研究神经退化性疾病的模式生物,通过绿色荧光蛋白(GFP)标记DJ-1蛋白,利用荧光蛋白技术及-DJ-1与GFP共定位技术在正常和氧化情况下研究其在盘基网柄菌的亚细胞定位,可以为探索D J-1蛋白亚细胞位置与致病机制之间的联系奠定基础.研究结果表明,正常情况下盘基网柄菌DJ-1蛋白位于细胞质内,一旦受到氧化应激,DJ-1蛋白则转移至线粒体,这个亚细胞位置转移与D J-1蛋白C117位点的氧化相关.该研究为探索DJ-1蛋白如何在氧化应激条件下完成对细胞的保护提供了实验依据.

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是一个应用广泛的模式生物,非常适合用来研究胞质分裂、细胞运动、吞噬作用、趋化性、趋电性、信号转导以及个体发育过程中的细胞分化.该实验主要介绍电穿孔技术转化绿色荧光蛋白标记肌动蛋白基因质粒(Lifeact-GFP)进入盘基网柄菌活细胞中,抗性筛选(潮霉素B)获得阳性克隆子,最后借助荧光显微镜观察绿色荧光蛋白标记的微丝在盘基网柄菌的分布情况.综合性实验训练可提高学生的学习兴趣和综合运用理论知识的能力,进而可培养学生的科学研究思维.

分子生物学是一门实验性很强的学科.对于生物技术专业的本科学生来说,实验课学习是提高实验技能和培养科研能力的重要途径.该实验教学改革引入“问题情境”教学,以“carA基因是否与盘基网柄菌细胞的趋化运动有关”这一问题为导向,利用盘基网柄菌细胞中carA基因的克隆为主线,串联起基因组DNA提取、目的基因的PCR扩增、质粒转化、质粒提取等分子生物学核心技术环节,鼓励学生自主探索,通过实验结果来解答问题.在实践教学中,教师通过对学生进行课前、课中和课后指导,帮助学生逐步养成自主学习习惯和提升科研能力,为今后从事生物学相关工作打下基础.

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是研究神经退行性病变的模式生物,可用以研究帕金森病相关基因DJ-1的作用和致病机理.本研究设计特异性引物扩增了人类DJ-1的盘基网柄菌同源基因片段DAM,并利用酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ将DAM插入质粒载体pQE-30产生重组载体pPROF696,序列测定后对DJ-1进行了生物信息学分析.同时,通过电穿孔法将pPROF696转入大肠杆菌M15,并利用IPTG诱导DJ-1蛋白表达.经SDS-PAGE分析、Western-blot印迹和His标签树脂对DJ-1粗蛋白纯化后进行抗体制备,并在大肠杆菌M15转化株和盘基网柄菌转化株与野生型内对抗体进行检验.结果表明:本研究成功构建了盘基网柄菌DJ-1的原核表达载体pPROF696,所制备的盘基网柄菌DJ-1多克隆抗体能成功检测大肠杆菌M15和盘基网柄菌野生型与转化株中的DJ-1蛋白.这为今后检测盘基网柄菌细胞内DJ-1的表达水平,建立其与盘基网柄菌表现型相关性,标记DJ-1的亚细胞定位和进一步研究DJ-1在帕金森病中的作用机理奠定了基础.

细胞趋电性在伤口愈合、胚胎形成、神经再生等领域至关重要.前期研究表明,细胞在脉冲电场下也能够定向移动,但目前多种非直流电场也被临床证实能有效地促进伤口愈合,而其机制尚不清楚.本研究设计了能产生连续变化电场的电刺激器,研究分析低频(10、5、1 Hz)正弦波、三角波和斜坡波电场下阿米巴细胞的运动特性,发现在正弦波电场组中,5 Hz电场下细胞比1 Hz导向性更高(P<0.01);在三角波电场组中,5 Hz电场下细胞迁移速率最高(P<0.001,P<0.001);在斜坡波电场组中,10 Hz电场下细胞导向性比5 Hz和1 Hz均低(P<0.001,P<0.001)而5 Hz电场下细胞迁移速率高于1 Hz(P<0.05),综合考虑5 Hz趋电性最好.把上述三组中最优电场与直流电场和脉冲电场对比,发现上述三种电场下细胞运动特性均优于50％占空比脉冲电场,更重要的是,5 Hz斜坡波下细胞导向性与直流电场下无明显差异(ns),而迁移速率优于后者(P<0.001),是本研究中具有最佳趋电性的电场.实验结果表明,低频变化电场也能够引起细胞定向迁移,不同波形电场下细胞趋电性差异明显,而5 Hz斜坡波电场具有基础和临床研究的应用潜力.

该研究对细胞生物学经典教学实验"细胞膜渗透性实验"进行重新设计.通过比较兔红细胞和盘基网柄菌细胞的"细胞膜渗透性"实验结果,配合细胞生物学"细胞质膜结构与功能"一章的教学,引导学生初步探究盘基网柄菌水孔蛋白(aquaporins,AQPs)在细胞抗低渗环境中的作用,加深理解细胞质膜中的功能蛋白对于细胞生存的重要意义.

目的 趋化性和趋电性是细胞定向迁移的主要方式,并在生物有机体的生理和病理过程中发挥重要作用,但二者存在差异.本文对盘基网柄菌gbpC和gbqD基因在细胞趋电性和趋化性中的作用进行对比研究,以寻找两种迁移方式之间的新差异.方法 将gbpC基因突变株gefT-和gbpD基因突变株gefU-分别置于场强为12 V/cm的直流电场中,分析细胞在电场中的运动方向及运动速度,探讨细胞的趋电性变化;利用电穿孔技术将标记F-actin的Lifeact-GFP质粒转化进入细胞,用荧光显微镜观察活细胞运动时F-actin的分布;用蛋白质印迹技术定量分析细胞的肌球蛋白调节轻链(RLC)在受直流电场刺激后的磷酸化变化情况.结果 gefT-突变株细胞极化消失,但保持与野生型类似的趋电性;gefU-突变株细胞发生超极化,但趋电性显著降低.在直流电场中,突变株细胞和野生型细胞的F-actin主要分布在伪足部位.在电场作用下,细胞株的肌球蛋白RLC磷酸化变化情况存在差异,即野生型细胞以时间依赖的方式发生磷酸化,gefT-突变株细胞先急剧下降,然后再上升,gefU-突变株细胞却以时间依赖方式脱磷酸化.结论 本研究表明gbpC和gbpD基因在盘基网柄菌趋化性和趋电性中的作用不同,暗示了电信号与化学信号确实通过不同的机理指导细胞的定向迁移.