目的:用高通量方法筛选口腔鳞癌放疗抵抗相关的激酶基因，为口腔鳞癌的临床治疗决策提供理论基础。方法:以慢病毒构建的短发夹核糖核酸(shRNA)激酶文库(含4 675个不同shRNA序列，覆盖709个人激酶基因)感染舌鳞癌Cal-27细胞，嘌呤霉素筛选去除未成功感染的细胞后，以光子射线进行照射(0、10和15 cGy)，然后继续培养3 d，以增加不同射线抗性细胞的丰度差异。提取细胞基因组DNA，利用PCR获得完整shRNA序列，同时每组引入不同标签序列，利用illumina平台进行二代测序，找出丰度发生显著变化的shRNA，其对应基因即为影响射线抗性的基因。结果:本次实验共筛选到5个影响口腔鳞癌放射线抗性的激酶基因，其中，PKLR和IPMK敲减后会增加射线抵抗，AURKB、ITPKB和DLG2敲减后会导致放射敏感，其高表达会导致患者对放疗耐受。结论:本研究利用shRNA慢病毒文库结合二代测序方法筛选到3个口腔鳞癌放射抵抗基因，但具体作用机制尚需进一步探究。

目的:探讨长链非编码核糖核酸-X染色体失活基因(lncRNA-XIST)对脊髓损伤大鼠神经元凋亡过程的影响及其作用机制。方法:将成年SD大鼠(北京中国科学院实验动物中心提供)随机分为假手术组、脊髓损伤组、观察组，假手术组接受椎板切除术，脊髓损伤组和观察组椎板切除后使用脊髓打击器损伤脊髓。假手术组和脊髓损伤组脊髓内注射空白慢病毒，观察组脊髓内注射转染慢病毒包装短发夹RNA(Lv-shRNA)的慢病毒，比较不同处理方式下各组大鼠运动功能评分、脊髓细胞凋亡及相关蛋白表达，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用 t检验。 结果:在各不同时间点，假手术组大鼠运动功能评分[(21.36±3.52)、(22.16±3.22)、(22.15±4.12)、(21.52±3.25)、(24.26±6.21)、(22.45±6.14)分]显著高于脊髓损伤组[(0.45±0.21)、(1.26±0.26)、(3.12±1.02)、(4.38±1.05)、(10.02±3.45)、(11.14±3.59)分]和观察组[(4.52±2.13)、(6.23±1.02)、(10.14±2.88)、(12.02±3.25)、(16.25±4.25)、(18.05±2.14)分， F＝9.505、8.425、2.302、9.565、4.825、3.052， P<0.05]，差异均有统计学意义；脊髓细胞凋亡率[(4.25±0.56)%、(4.56±0.74)%、(5.12±1.02)%、(3.85±0.52)%]显著低于脊髓损伤组[(45.85±7.81)%、(43.87±6.85)%、(47.85±3.48)%、(44.85±6.25)%]和观察组[(23.42±3.25)%、(21.05±4.15)%、(26.45±5.87)%、(24.95±6.14)%， F＝7.105、8.825、8.114、9.514， P<0.05]，差异均有统计学意义；磷酸化-Akt、磷酸化-mTOR显著高于脊髓损伤组[(0.15±0.02)、(0.17±0.03)]和观察组[(0.85±0.05)、(0.74±0.03)， F＝7.814、8.825， P<0.05]，差异均有统计学意义。而观察组大鼠运动功能评分、磷酸化-蛋白激酶B(Akt)、磷酸化-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)显著高于脊髓损伤组，细胞凋亡率显著低于脊髓损伤组。 结论:长链非编码RNA-XIST可以通过促进磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路活化，促进脊髓损伤的神经元凋亡。

目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是好发于中老年的浆细胞恶性肿瘤,发病机制尚不清楚.由于其多发、复发、耐药的特点,MM仍是一种无法治愈的疾病.氨基酸代谢异常是MM的重要特征之一.氨基酸重要的代谢途径是作为基本原料参与蛋白质合成.氨酰转移核糖核酸合成酶(aminoacyl transfer ribonucleic acid synthetase,ARS)基因是蛋白质合成过程中的关键调节基因.本研究旨在探究在MM中异常表达的氨基酸代谢关键因子ARS通过调控氨基酸代谢影响MM生长的分子机制.方法:对应基因编号合并基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中基因表达谱GSE5900数据集及GSE2658数据集数据,对ARS家族基因表达数据进行标准化处理.采用GSEA_4.2.0软件分析健康供者(healthy donor,HD)与MM患者基因富集的差异.采用GraphPad Prism 7绘制基因热图并进行数据分析.采用Kaplan-Meier及Cox回归模型分别对ARS家族基因表达与MM患者预后情况进行单因素及多因素回归分析.收集7例MM初诊患者的骨髓样本,使用CD138抗体磁珠分选获得CD138+、CD138-细胞,采用real-time RT-PCR分析ARS在MM临床样本中的表达情况.以人B淋巴细胞GM12878细胞,人MM细胞系ARP1、NCI-H929、OCI-MY5、U266、RPMI 8266、OPM-2、JJN-3、KMS11、MM1.s细胞为研究对象,采用real-time RT-PCR及蛋白质印迹法分析ARS在MM细胞系中的表达情况.利用短发夹核糖核酸(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒构建基因敲减质粒(VARS-sh组),将其与空载质粒(scramble组)分别转染HEK 293T细胞后进行病毒包装,分别感染ARP1、OCI-MY5细胞并建立稳定表达的细胞系,分别采用细胞计数法和流式细胞术检测敲减缬氨酰tRNA合成酶(valyl-tRNA synthetase,VARS)基因对MM细胞增殖和凋亡的影响.根据VARS表达将GEO数据分为高表达组和低表达组,通过生物信息学分析探索VARS影响的下游通路,采用飞行时间质谱(gas chromatography time-of-flight/mass spectrometry,GC-TOF/MS)及高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分别检测临床患者骨髓样本CD138+细胞及敲减VARS基因的ARP1、OCI-MY5细胞及上清液中缬氨酸含量.结果:基因富集分析结果表明:与HD相比,tRNA加工相关的基因在MM中显著富集(P<0.0001).进一步筛选tRNA加工通路相关子集发现胞质氨酰tRNA合成酶家族基因在MM中显著富集(P<0.0001).基因表达热图结果表明GEO数据中ARS家族基因除丙氨酰tRNA合成酶(alanyl-tRNA synthetase,AARS)、精氨酰tRNA合成酶(arginyl-tRNA synthetase,RARS)、丝氨酰tRNA合成酶(seryl-tRNA synthetase,SARS)外,其余ARS家族基因均在MM中高表达(均P<0.01),且随着意义未明单克隆丙种球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)到MM的发展进程,基因表达水平逐渐增加.Kaplan-Meier生存情况单因素分析结果表明甲硫氨酰tRNA合成酶(methionyl-tRNA synthetase,MARS)、天冬酰胺基tRNA合成酶(asparaginyl-tRNA synthetase,NARS)、VARS高表达组与低表达组MM患者预后情况差异均具有统计学意义(均P<0.05).Cox回归模型多因素分析结果表明:VARS的高表达与MM的总生存时间异常有关(HR=1.83,95%CI 1.10～3.06,P=0.021);NARS(HR=0.90,95%CI 0.34～2.38)及MARS(HR=1.59,95%CI 0.73～3.50)的高表达均对MM患者的总生存时间无影响(均P>0.05).Real-time RT-PCR及蛋白质印迹法结果表明VARS、MARS和NARS在临床患者CD138+MM细胞及MM细胞系中均高表达(均P<0.05).细胞计数法及流式细胞术结果表明,敲减VARS的MM细胞增殖能力被显著抑制(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).生物信息学分析结果表明除包括细胞周期在内的通路受VARS调控外,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解代谢通路被上调.非靶向代谢组学数据表明:与HD相比,MM患者的CD138+MM细胞中缬氨酸含量降低(P<0.05).HPLC结果表明:与scramble组相比,VARS-shRNA组的ARP1细胞与培养基上清液及OCI-MY5培养基上清液中缬氨酸含量均增加(均P<0.05).结论:VARS在MM中异常高表达,且与MM患者的不良预后相关.VARS可通过影响缬氨酸代谢调控促进MM细胞的生长.

目的 探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原.方法 用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴.将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的未知抗原.采用流式细胞术测定PAEC表面结合的猴抗猪细胞抗体的平均荧光强度(MFI),用以表示PAEC表面抗原的含量.利用慢病毒介导的短发夹核糖核酸(shRNA)敲减PAEC中的FAM234A基因,检测该细胞结合的猴抗猪细胞抗体含量是否减少,以确定该基因是否为潜在的移植抗原.结果 PAEC中的非Gal抗原能够在猴体内引发大量的猴抗猪细胞抗体.在GTKO小型猪的PAEC中用shRNA敲减FAM234A基因后,PAEC结合的猴IgG抗体减少.结论 FAM234A是一种新的非Gal异种移植抗原.

目的 探寻外周髓磷脂蛋白22(PMP22)的下游关联基因及其通路,为揭示胃癌化疗(CTx)抵抗的分子机制提供基础.方法 基因表达数据库(GEO)获取短发夹核糖核酸敲减和未敲减PMP22的数据库系列(GSE)数据GSE94714,数据库R语言(GEO2R)分析差异表达基因,筛选后行富集和通路分析,互作基因检索工具(STRING)数据库建立蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,细胞图景(Cytoscape)的分子复合物探测(MCODE)模块分析,细胞核心插件(CytoHub-ba)筛选网络中的关键基因,癌症药物敏感性基因组学(GD-SC)数据库分析基因与药物敏感性的关系.结果 PMP22下游10倍变化的差异基因314个,上调283个,下调31个,主要富集于细胞黏着连接、细胞-细胞黏附、多聚腺嘌呤核糖核苷酸结合和细胞周期通路.PPI中4个亚模块主要与剪接体、泛素介导的蛋白水解通路(P＜0.01)和3个反应组学(REACTOME)通路(P＜0.05)关联,最大集团中心性(MCC)算法得到包括肽基脯氨酰异构酶E(PPIE)、核内不均一性核糖核蛋白A1(HNRNPA1)、Y框结合蛋白1(YBX1)的关键基因10个,富含腺嘌呤胸腺嘧啶(AT)蛋白质1A交互域(ARID1A)、死亡盒(DExH)解旋酶9(DHX9)与癌细胞对顺铂的敏感性有关.结论 PMP22主要通过多种细胞组分、分子功能、生物过程和通路参与胃癌CTx抵抗,ARID1A等关键基因和细胞周期、剪接体、泛素介导的蛋白水解通路是治疗胃癌PMP22相关CTx抵抗的潜在靶点.

目的 观察Wnt-1诱导分泌蛋白2(WISP-2)基因敲降与乳腺癌细胞增殖活性的相关性以及WISP-2调控S期激酶相关蛋白2(Skp2)和p27Kip1在乳腺癌移植瘤形成中的作用.方法 MCF-7乳腺癌细胞分为三组:A组为正常培养细胞;B组为WISP-2短发夹RNA(shRNA)质粒转染细胞;C组为空质粒转染细胞.MTT法检测WISP-2基因敲降对MCF-7细胞增殖活性的影响.取45只SPF级健康BALB/c雌性裸鼠,随机均分为D、E和F三组,分别于裸鼠右腋部皮下接种0.2mL携带WISP-2 shRNA质粒转染、空质粒转染和正常培养的生长密度为每毫升1×106个的MCF-7细胞;14d后,肿瘤最小直径达到0.5 cm视为移植瘤形成.分别采用荧光定量RT-PCR法和Westernblot法检测三组移植瘤中WISP-2、Skp2和p27Kip1 mRNA和蛋白水平.结果 B组细胞增殖活性高于A组和C组(P＜0.05).D组WISP-2和p27Kip1 mRNA和蛋白水平低于E组和F组(P＜0.05),而Skp2 mRNA和蛋白水平高于E组和F组(P＜0.05).结论 WISP-2基因敲降导致Skp2和p27Kip1mRNA和蛋白水平异常,诱导乳腺癌细胞增殖,促进乳腺癌移植瘤形成.

B细胞介导的抗病毒体液免疫应答过程涉及大量基因的上调表达,为快速鉴定这些基因的功能,需在体外建立一种有效敲低B细胞中目的基因表达以研究基因功能的方法,但目前已有的方法转导效率较低且很少将B细胞转移到小鼠体内以观察其增殖和分化.本研究首先将Drosha酶特异性小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)与反转录病毒包装质粒共转染至病毒包装细胞中,大大提高了病毒的滴度;其次,在培养基中加入抗CD180抗体,构建了原代B细胞的体外培养体系,使B细胞在保持自身特性的同时具有较强的增殖能力;再次,增加离心感染(spin infection)次数,进一步提高了B细胞的转导效率;另外,通过小鼠预先感染,可收获更多增殖、分化的B细胞以供表型分析.通过上述改进措施,成功敲除了B细胞功能基因Bcl6的表达,验证了其抗凋亡功能.该方法的建立为研究病毒急、慢性感染中B细胞的增殖、分化与缺陷机制奠定了良好基础.

目的 探讨磷酸二酯酶5(PDE5)短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒载体[PDE5shRNA]导入后的间充质干细胞(MSCs)对心肌梗死(MI)后心室重构的影响.方法 构建PDE5shRNA转染的MSCs,结扎大鼠冠状动脉左前降支(LAD)建立MI模型,随机分成假手术组(n =4,只穿线不结扎LAD);模型组(n =4,穿线并结扎LAD建立MI模型);MSCs-Ad-Null组(n =4,MI模型基础上注射经空白腺病毒载体转染的MSCs);MSCs-shRNA-PDE5组(n =4,MI模型基础上注射经PDE5shRNA转染的MSCs).建模后,每组各取1只大鼠取心脏进行病理检验,用于判断造模成功,余大鼠入组观察相关指标.4周后心脏超声检测各组大鼠心功能指标[左室收缩末期内径(LVESd)、左室舒张末期内径(LVEDd)、左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(FS)].HE染色观察心肌病理改变,Masson染色观察心肌纤维化情况,qRT-PCR方法检测大鼠心肌中PDE5、环磷酸鸟苷(cGMP)和蛋白激酶(PKG)mRNA的相对表达量.结果 实验4周后,(1)心脏超声示:MI各组大鼠心室腔明显扩张,左心室心肌收缩功能明显降低.与假手术组相比,MI各组大鼠的LVESd、LVEDd增大,LVEF、FS降低(P均＜0.05);与模型组相比,MSCs-Ad-Null组、MSCs-shRNA-PDE5组的 LVESd、LVEDd 降低,MSCs-shRNA-PDE5组的 LVEF、FS 升高(P均＜0.05).(2)心肌病理结果示:与模型组比较,MSCs-Ad-Null组、MSCs-shRNA-PDE5组的心肌病理改变逐渐减轻.(3)qRT-PCR法结果示:与假手术组相比,模型组、MSCs-Ad-Null 组PDE5 mRNA表达升高、cGMP和PKG mRNA表达降低(P均＜0.05);按模型组→MSCs-Ad-Null 组→MMSCs-shRNA-PDE5 组之序,PDE5 mRNA 表达递降,cGMP、PKG mRNA 表达递升(P＜0.05,P＜0.01).结论 PDE5shRNA导入后的MSCs可改善MI后心功能,减轻心肌病理改变及心肌纤维化,同时通过调节PDE5、cGMP、PKG的表达,发挥抑制心室重构的作用.

目的 构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因短发夹RNA表达载体并鉴定,为探讨GRP78对胃癌发生发展作用及机制提供前期基础.方法 运用核糖核酸(RNA)干扰技术构建靶向干扰GRP78蛋白短发夹RNA(GRP78-shRNA)载体,载体经转化、抽提及测序,用脂质体将GRP78-shRNA载体瞬时转染至SGC-7901胃癌细胞中,应用荧光显微镜、反转录定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)观察GRP78表达情况.结果 GRP78-shRNA载体测序显示序列正确;转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞可见绿色荧光;qRT-PCR和Western blot结果显示,转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞中GRP78基因和蛋白表达降低.结论 成功构建并鉴定GRP78基因短发夹RNA表达载体.

目的 筛选肺鳞状细胞癌(squamous cell lung carcinoma,SQCLC)中差异表达且具有临床意义的潜在靶基因,并探究其在癌组织中的表达及其调控肺鳞状细胞癌发生发展的分子机制.方法 通过临床数据库GEPIA找出在肺鳞状细胞癌中差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs),进一步筛选出相较于正常肺组织表达差异性最显著的LncRNAs作为研究目的基因.通过PholyCSF数据库预测目的基因在肺鳞状细胞癌中发挥功能的形式.通过短发夹RNA(shRNA)介导敲低目的基因表达,利用细胞增殖实验、克隆形成实验验证目的基因在肺鳞状细胞癌发生发展中的重要性;通过分析与目的基因共表达基因参与的信号通路,探索其在肺鳞状细胞癌中发挥功能的潜在分子机制.结果 研究最终选取在肺鳞状细胞癌中显著差异高表达的MIR205HG作为目的基因进行实验探究.肺鳞状细胞癌组织中MIR205HG表达显著高于正常肺组织(6.785±0.462 vs 1.084±0.036),差异有统计学意义(t=188.873,P<0.05),且随着临床分期越高MIR205HG表达水平越高(P=0.0472).MIR205HG主要通过LncRNA形式在肺鳞状细胞癌中发挥功能.与shCTL组(0.988±0.039)相比,shMIR205HG#1组(0.709±0.032)和shMIR205HG#2组(0.736±0.026)细胞的增殖率明显降低,差异有统计学意义(F=66.163,P<0.001).shMIR205HG#1组(0.324±0.021)和shMIR205HG#2组(0.402±0.023)细胞克隆形成速率明显低于shCTL对照组(1.809±0.019),差异有统计学意义(F=423.093,P<0.001).shMIR205HG#1组(5.988±0.321)和shMIR205HG#2组(5.702±0.345)细胞中P53蛋白表达明显高于shCTL对照组(1.022±0.152),差异有统计学意义(F=285.386,P<0.001).shMIR205HG#1组(3.857±0.362)和shMIR205HG#2组(3.698±0.314)细胞中下游P21蛋白表达亦明显高于shCTL对照组(1.106±0.253),差异有统计学意义(F=73.106,P<0.001).结论 lncRNA MIR205HG在肺鳞状细胞癌中显著高表达,可能通过P53信号通路参与肺鳞状细胞癌的增殖和克隆形成,可作为肺鳞状细胞癌的潜在药物治疗靶点.