目的 比较精液冷冻前、复苏后精子参数以及精子质膜蛋白磷脂酶C-zeta(Phospholipase C-zeta,PLCζ)表达水平的变化,探究冷冻保存对人类精子PLCζ的损伤作用.方法 选取2022 年2 月—2023 年7 月在本中心进行辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)治疗的不育男性患者30 份正常精液标本.将每份精液均分为冻前新鲜组和复苏后冷冻组.比较分析冷冻前、复苏后精子的活力(PR级),存活率和形态变化;密度梯度离心处理两组精液标本,通过免疫荧光和Western blot技术检测精子PLCζ表达水平.结果 与新鲜精子相比,冷冻保存明显降低精子的前向运动精子百分率(31.8%±5.5%)vs(59.3%±7.4%)(P<0.01),精子活动率(38.7%±4.6%)vs(69.07%±6.7%)(P<0.01)和精子存活率(48.2%±6.1%)vs(83.4%±7.2%)(P<0.01),精子正常形态率也发生改变(3.4%±0.7%)vs(12.4%±3.3%)(P<0.01),尾部卷曲的异常形态比例增多;冷冻复苏精子PLCζ荧光免疫反应减弱(33.08±9.74)vs(114.1±12.92)(P<0.01),染色为散在红色点状荧光,且特征性的染色定位缺失;Western blot实验中,精子PLCζ蛋白表达明显减弱.结论 冷冻保存不仅对精子参数有负面影响,同时对精子质膜蛋白PLCζ有损伤作用.

受精时,精子诱导卵母细胞胞浆内Ca2+发生一系列升高,成熟的卵母细胞激活进而继续发育,这个过程称为钙振荡.钙振荡在卵胞浆内单精子注射(ICSI)后也会出现,它主要由精子蛋白磷脂酶C-zeta(PLCζ)触发.目前,ICSI是使卵母细胞受精的有效方法,但一部分卵母细胞在ICSI后仍受精失败,这种情况似乎与PLCζ缺乏有关.在辅助生殖领域常通过卵母细胞人工激活(AOA)技术来改善受精失败患者的结局.本研究综述了卵母细胞激活的科学背景,并对AOA技术做了一些讨论.

通常认为卵母细胞在成熟分裂促进因子(matura-tion-promoting factor, MPF) 和细胞生长抑制因子(cyso-static factor, CSF)的作用下,发育并停滞于第二次减数分裂中期,在精子或某些理化因素的刺激下卵母细胞才能恢复并完成减数分裂,这一过程称为卵母细胞激活(oocyte activation, OA)[1].1990年,Swann等人通过将精子内提取物注射入卵母细胞内,并观察到受精成功的信号——钙离子振荡,首次提出关于"精子因子"的证据 [2].精源性卵母细胞激活因子(sperm-borne oocyte activation factor,SOAF)被认为是精卵质膜融合后,由精子向卵母细胞质内释放的一种或多种可溶性蛋白,可以启动信号转导通路,通过诱导钙离子振荡以达到激活卵母细胞的目的.目前广泛接受并唯一已明确的关键SOAF是磷脂酶C-zeta (phospholipase C zeta, PLCζ)[4],已有多项研究证实,精子内PLCζ蛋白的缺乏、位置异常、活性及表达异常、相关基因突变与ICSI失败及男性不育相关[4].但其后续激活钙离子振荡和卵母细胞激活的机制仍未完全阐明;同时,在部分文献中提出其他可能作为SOAF的候选蛋白,但目前仍存在争议.本文旨在对SOAF的可能候选蛋白及其相关作用机制进行总结.

目的 利用CRISPR/Cas9系统构建精子特异性磷脂酶C zeta-1(phospholipase C zeta1,Plcz1)基因敲除(Plcz1-/-)小鼠模型,探讨Plcz1基因在雄性小鼠生育过程中的作用.方法 选择小鼠Plcz1基因第6、7外显子作为靶位点,前后两个位点设计2对sgRNA序列,再将2对sgRNA以Golden Gate方法插入pX330A质粒中,构建pX330-sgRNA重组质粒.经扩增、纯化后,将重组质粒显微注射进小鼠受精卵原核中,进行胚胎移植至代孕母鼠,F0代小鼠出生后,提取其尾DNA进行PCR鉴定和DNA测序分析.通过F0代与野生型小鼠交配得到F1代小鼠,F1代交配繁殖至F2代获得Plcz1基因缺失的小鼠纯合品系,Plcz1-/-与野生型小鼠交配,分析Plcz1-/-雄鼠的生育能力.结果 成功构建pX330-sgRNA重组质粒,通过繁育和测序筛选获得3只Plcz1-/-雄鼠(Plcz1m3、Plcz1m4、Plcz1m5),对3只小鼠进行目的基因测序发现:(1)Plcz1m3:Plcz1基因第6、7外显子区域缺失3078 bp;(2)Plcz1m4:第7外显子区域缺失7 bp,该小鼠在饲养过程中死亡;(3)Plcz1m5:Plcz1基因第6外显子区域缺失1 bp.结论 利用CRISPR/Cas9,成功获得Plcz1-/-雄性小鼠,Plcz1-/-雄性小鼠可育,但与野生型小鼠相比,其生育能力明显下降.

目的 本实验研究Gal/GalNAc-胆固醇(cholesterol,CHS)配体中连接臂的亲水/疏水性及其修饰的脂质体表面荷电性对去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)亲和力的影响,为构建高效的Gal//GalNAc配体修饰的靶向肝癌细胞递药载体提供理论指导和实验依据.方法 采用酶促法合成具有疏水性连接臂的Gal/GalNAc-CHS配体:CHS-C8-GalNAc、CHS-C8-Gal、CHS-C8-Lac 和具有亲水性连接臂的 Gal/GalNAc-CHS 配体:CHS-DIO-GalNAc,其中 CHS-DIO-GalNAc 为首次报道.将hydrogenated soya phosphatide(HSPC)、CHS和各种配体按(6∶3∶1)摩尔比例混合(如制备阴离子脂质体则加入脂质总质量1％的DSPG-Na),然后采用薄膜分散-高压挤出-硫酸铵梯度法制备配体修饰载多柔比星脂质体.以小鼠为实验对象,采用尾iv给药,对比4种Gal/GalNAc配体修饰的多柔比星脂质体在小鼠体内血液和肝组织分布特征.结果 CHS-DIO-GalNAc经MS、NMR和HMBC鉴定为目标产物,产率＞90％;制得脂质体外观圆整,边缘清晰,粒径介于60-75 nm,Zeta电位介于-6-+5 mV(阴离子脂质体Zeta电位介于-4--17 mV),poly dispersity index＜0.1,包封率＞98％,泄露率＜3％.小鼠体内实验结果显示CHS-DIO-GalNAc修饰的脂质体在血液中的消除速率、肝脏组织的蓄积率均显著高于由CHS-C8-GalNAc、CHS-C8-Gal和CHS-C8-Lac修饰的脂质体.通过体内ASGPR竞争性抑制实验,证明小鼠体内肝脏对CHS-DIO-GalNAc和CHS-C8-Gal-NAc配体修饰脂质体的高摄取率是由肝实质细胞膜表面ASGPR介导的主动内吞作用.结论 Gal/GalNAc配体结构中连接臂的亲水性越强,ASGPR对脂质体表面修饰的Gal/GalNAc的识别效率越高.脂质体中加入负电荷磷脂可协同增强ASGPR对脂质体表面修饰的Gal/GalNAc配体亲和力.本研究成果将为设计ASGPR高亲和力的Gal/GalNAc配体提供有益的指导.