目的:观察附子-白术“药对”对成骨细胞分化和增殖的影响,并从调控BMP-2/Smads/Runx2通路方面探讨其作用机制.方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,分别用低、中、高剂量(1、10、100mg/mL)的附子-白术“药对”进行药物干预,MTT法检测成骨细胞的增殖,ELISA法检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blot检测成骨细胞BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2及Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:药对低、中剂量组在570nm处的吸光度值及ALP的活力均明显高于对照组(P＜0.05,P＜0.01),高剂量组在570nm处的吸光度值明显低于对照组(P＜0.01),且高剂量组ALP的活力明显高于低、中剂量组(P＜0.05,P＜0.01);药对低、中剂量组成骨细胞BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2及Ⅰ型胶原蛋白的表达均胶对照组明显升高(P＜0.05,P＜0.01).结论:附子-白术“药对”可促进成骨细胞的增殖和分化,其机制可能与其激活BMP-2/Smads/Runx2信号通路,促进Ⅰ型胶原表达相关.

目的 利用BMP-Smad信号通路在成骨分化中的作用,筛选出较稳定且成骨率较高的小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞的方案.方法 小鼠胚胎干细胞经悬浮培养形成拟胚体(embryoidbodies, EBs),用胰酶消化成单个细胞接种至6孔板中,在EBs单细胞贴壁生长的第14～21天,A组(方案1)添加50 μg/mL维生素C +50 mmol/L β - 磷酸甘油 + 10-8mol/L地塞米松;B组(方案2)添加50 μg/mL维生素C + 10 mmol/L β - 磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松;C组(方案3)添加50 μg/mL维生素C + 50 mmol/L β - 磷酸甘油+1 μmol/L地塞米松;D组为正常对照组,不添加诱导剂.各组均在在贴壁第7、14、21、28天检测碱性磷酸酶(ALP)活性,第22天用1％茜素红染色鉴定成骨细胞.采用荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测BMP-Smad信号通路中的BMP2、BMPR2、Smadl和Smad5等关键mRNA和蛋白的表达组平.结果 与正常对照组相比,各组均在EBs贴壁第7天后ALP活力逐渐增强,且均在第21天增至最强.茜素红染色结果 显示,阳性细胞被染成橘红色、呈大小不等的结节状.计算成骨细胞诱导形成率,A组、B组、C组和D组成骨细胞形成率分别为15.34％、23.71％、29.12％和0.66％.Q - PCR和Western blot检测结果 显示,与正常对照组相比,各组BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的mRNA和蛋白表达水平有不同程度的升高和降低,其中C组(方案3)的BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的相对表达量均升高,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 添加50 |xg/mL维生素C +50 mmol/Lβ-磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松的方案成骨细胞诱导形成率最多,可最大量诱导骨结节的形成.

该文研究了Notch信号在骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用及机制.利用过表达 Notch配体之一DLL1的腺病毒(adenovirus-delta-like 1,Ad-DLLl)、显性负性突变型Notchl受体的腺病毒(adenovirus-dominant-negative mutant of Notch1,Ad-dnNotchl)或γ-分泌酶抑制剂{N-[N-(3,5-difluorophena-cetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT}处理MEFs,细胞化学染色和/或活性测定检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达、钙盐沉积;qRT-PCR、Western blot、荧光素酶分别检测BMP2信号I、II型受体和成骨基因表达、Smadl/5/8蛋白磷酸化水平及Smad结合元件(Smad-binding element,SBE)转录活性.结果显示,DLL1促进BMP2介导MEFs早晚期成骨分化,并上调ALK2等受体的mRNA水平、Smadl/5/8的磷酸化水平及SBE转录活性;与之相对应,dnNotchl和DAPT抑制上述指标.Notch经典靶基因发状分裂相关增强子l(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1,Hey1)可促进BMP2诱导成骨分化,并逆转DAPT对BMP2诱导成骨分化的抑制作用.该研究结果提示,Notch信号促进BMP2诱导MEFs成骨分化,可能是通过激活BMP2/Smads通路实现的,这一过程中Hey1发挥了重要作用.

背景:肝纤维化与肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)相关,TGF-β1在其中起着重要的作用,而BMP7能够拮抗TGF-β1,目前主要研究的是TGF-β/BMPs-Smad信号通路,ALK3属于BMPs的持续活化Ⅰ型受体,在肝纤维化分子研究机制中较少运用.目的:观察大鼠HSCs中稳定表达持续活化型ALK3时Smad1磷酸化及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等表达情况,探讨BMP-7信号转导在肝纤维化发生发展过程中拮抗TGF-β1信号及其抗肝纤维化机制.方法:建立体外培养大鼠HSCs (HSC-T6)持续活化型ALK3的稳定表达细胞株,MTT检测细胞的增殖;RT-PCR检测col1A2等相关分子mRNA水平;Western blotting检测Samd1、E-cadherin、α-SMA、col1A2蛋白表达和Smad1磷酸化;显微镜下观察细胞形态.结果:稳定表达持续活化型ALK3的HSC-T6细胞增殖受到抑制,Smad1磷酸化显著升高,α-SMA,col1A2表达下调,E-cadherin表达上调.结论:BMP-7信号转导通过增强Samd1的磷酸化而拮抗TGF-β1致纤维化作用,抑制大鼠HSCs的活化.

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病,其特点是骨量低、骨微结构恶化、骨脆性增加、易骨折.为了改善骨质疏松,需要寻找合成代谢和口服药物的副作用最小的替代药物.补骨脂素是从中草药中提取的香豆素衍生物.然而,补骨脂素在成骨细胞功能中的作用及其分子机制尚不清楚.本研究发现,补骨脂素通过上调成骨细胞特异性标志基因(包括icollagen,骨钙素和骨唾液蛋白)的表达,增强碱性磷酸酶的活性,以剂量依赖的方式促进小鼠原代成骨细胞的成骨分化.本研究同时证明补骨脂素能上调BMP2和BMP4基因的表达,提高磷酸化smadl/5/8蛋白水平,激活BMP报告基因(12xbe-oc-luc)的活性以及增强BMP信号直接靶基因osx的表达.BMP2和BMP4基因的缺失消除了补骨脂素对成骨细胞标志基因coll、alp、oc和bsp表达的促进作用.结果 表明,补骨脂素通过激活BMP信号促进成骨细胞分化,提示补骨脂素可能是治疗骨质疏松等骨丢失相关疾病的一种潜在的合成代谢剂.

该文旨在探讨人微小核糖核酸-378(hsa-miR-378)通过靶向骨形态发生蛋白-2(BMP-2)/SMAD1信号通路影响人牙髓干细胞向成牙本质分化的作用.自牙髓组织分离并培养人牙髓干细胞,转染携带阴性对照(NC)、hsa-miR-378抑制剂(hsa-miR-378 inhibitor)、hsa-miR-378模拟物(hsa-miR-378 mimics)的慢病毒载体,分别记为 NC组、hsa-miR-378 inhibitor组、hsa-miR-378 mimics组,另取未处理细胞记为Blank组(仅添加等量无菌生理盐水).间充质干细胞分子标记物STRO-1、CD105、CD90阳性表达率高,造血干细胞分子标记物CD34、CD45阳性表达率低;NC组、hsa-miR-378 inhibitor组和hsa-miR-378 mimics组细胞的转染效率高;与Blank组和NC组相比,hsa-miR-378 mimics组细胞碱性磷酸酶(ALP)染色变浅,ALP活性和细胞吸光度值降低(P＜0.01),矿化结节数目明显减少,hsa-miR-378 inhibitor组细胞ALP染色加深,ALP活性和细胞吸光度值上升(P＜0.01),矿化结节数目明显增多;与Blank组和NC组比,hsa-miR-378 mimics组细胞hsa-miR-378表达上升(P＜0.01),BMP-2、SMAD1、牙本质基质蛋白1(DMP-l)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨钙素(OCN)mRNA和蛋白表达降低(P＜0.05或P＜0.01),hsa-miR-378 inhibitor组细胞hsa-miR-378表达下降(P＜0.01),BMP-2、SMADl、DMP-1、DSPP、OCN mRNA和蛋白表达上升(P＜0.05或P＜0.01);hsa-miR-378可介导BMP-2表达.miR-378低表达可促进牙髓干细胞向成牙本质分化,这可能与靶向激活BMP-2/SMAD1信号通路相关.