目的 观察藤黄健骨丸对绝经后骨质疏松症模型大鼠的治疗作用.方法 将72只雌性大鼠随机分为6组,分别为假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、仙灵骨葆胶囊组(XLGB)、藤黄健骨丸低剂量组(THJGW-L)、藤黄健骨丸中剂量组(THJGW-M)及藤黄健骨丸高剂量组(THJGW-H).手术造模3d后给药,除假手术组、模型组灌胃蒸馏水外,其余4组均按照相应剂量灌胃药物.连续灌胃8周后,分别检测大鼠术后各阶段体质量、子宫和肾脏重量、骨强度值,观察股骨病理变化.Western-blot法检测大鼠股骨中Runx2、BMP-2和Smad1蛋白表达水平.结果 实验结果显示,藤黄健骨丸可以增加去卵巢大鼠的子宫和肾脏重量,能够提高去卵巢大鼠的股骨荷载力,改善骨微结构,增加钙离子沉积,增加骨细胞数量.Western-blot结果显示去势大鼠骨组织中Runx2、BMP-2和Smad1相对蛋白水平降低,经过藤黄健骨丸治疗后,Runx2、BMP-2和Smad1相对蛋白水平显著升高.结论 藤黄健骨丸可以提高去势大鼠骨强度,改善骨组织形态,其作用机制可能与调控BMP-2/Smad信号通路来促进骨形成,对绝经后骨质疏松症有一定的治疗作用.

目的:观察附子-白术“药对”对成骨细胞分化和增殖的影响,并从调控BMP-2/Smads/Runx2通路方面探讨其作用机制.方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,分别用低、中、高剂量(1、10、100mg/mL)的附子-白术“药对”进行药物干预,MTT法检测成骨细胞的增殖,ELISA法检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blot检测成骨细胞BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2及Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:药对低、中剂量组在570nm处的吸光度值及ALP的活力均明显高于对照组(P＜0.05,P＜0.01),高剂量组在570nm处的吸光度值明显低于对照组(P＜0.01),且高剂量组ALP的活力明显高于低、中剂量组(P＜0.05,P＜0.01);药对低、中剂量组成骨细胞BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2及Ⅰ型胶原蛋白的表达均胶对照组明显升高(P＜0.05,P＜0.01).结论:附子-白术“药对”可促进成骨细胞的增殖和分化,其机制可能与其激活BMP-2/Smads/Runx2信号通路,促进Ⅰ型胶原表达相关.

目的 探讨卵丘颗粒细胞骨形态发生蛋白(BMP)-15、BMP-6信号通路分子表达对受精卵发育能力的影响.方法 收集2012年4月～2014年6月,因男性不育症行卵泡浆内单精子显微注射技术(ICSI)助孕的119例病例,456份单个卵子的卵丘颗粒细胞,采用免疫细胞化学,Western blotting方法检测颗粒细胞BMP-15、BMP-6信号通路分子蛋白的表达,采用Real-time PCR方法检测BMP-15、BMP-6信号分子基因表达.比较分析卵子ICSI后发育形成囊胚组与非囊胚组卵丘颗粒细胞BMP-15、BMP-6信号分子表达差异.结果 对两组卵丘颗粒细胞,进行了免疫细胞化学,Real-time PCR,Western blotting分析,结果发现,BMP-15、BMP-6、AKL2、AKL6、BMPRⅡ、Smad1、Samd4、Smad5、Samd8及E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)在两组颗粒细胞中均有表达,其中BMP-15、BMP-6、AKL2、AKL6,BMPRⅡ、Smad1 Samd4及ZEB1表达,组间比较差异具有显著性(经Bonferroni校正P＜0.005).而Smad5、Samd8表达,组间比较差异无显著性(P＞0.05).结论 卵丘颗粒细胞BMP-15、BMP-6、AKL2、AKL6、BMPRⅡ、Smad1、Samd4及ZEB1信号通路分子可能通过信号通路的调控作用,对受精卵发育能力产生影响.

目的 利用BMP-Smad信号通路在成骨分化中的作用,筛选出较稳定且成骨率较高的小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞的方案.方法 小鼠胚胎干细胞经悬浮培养形成拟胚体(embryoidbodies, EBs),用胰酶消化成单个细胞接种至6孔板中,在EBs单细胞贴壁生长的第14～21天,A组(方案1)添加50 μg/mL维生素C +50 mmol/L β - 磷酸甘油 + 10-8mol/L地塞米松;B组(方案2)添加50 μg/mL维生素C + 10 mmol/L β - 磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松;C组(方案3)添加50 μg/mL维生素C + 50 mmol/L β - 磷酸甘油+1 μmol/L地塞米松;D组为正常对照组,不添加诱导剂.各组均在在贴壁第7、14、21、28天检测碱性磷酸酶(ALP)活性,第22天用1％茜素红染色鉴定成骨细胞.采用荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测BMP-Smad信号通路中的BMP2、BMPR2、Smadl和Smad5等关键mRNA和蛋白的表达组平.结果 与正常对照组相比,各组均在EBs贴壁第7天后ALP活力逐渐增强,且均在第21天增至最强.茜素红染色结果 显示,阳性细胞被染成橘红色、呈大小不等的结节状.计算成骨细胞诱导形成率,A组、B组、C组和D组成骨细胞形成率分别为15.34％、23.71％、29.12％和0.66％.Q - PCR和Western blot检测结果 显示,与正常对照组相比,各组BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的mRNA和蛋白表达水平有不同程度的升高和降低,其中C组(方案3)的BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的相对表达量均升高,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 添加50 |xg/mL维生素C +50 mmol/Lβ-磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松的方案成骨细胞诱导形成率最多,可最大量诱导骨结节的形成.

该文研究了Notch信号在骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用及机制.利用过表达 Notch配体之一DLL1的腺病毒(adenovirus-delta-like 1,Ad-DLLl)、显性负性突变型Notchl受体的腺病毒(adenovirus-dominant-negative mutant of Notch1,Ad-dnNotchl)或γ-分泌酶抑制剂{N-[N-(3,5-difluorophena-cetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT}处理MEFs,细胞化学染色和/或活性测定检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达、钙盐沉积;qRT-PCR、Western blot、荧光素酶分别检测BMP2信号I、II型受体和成骨基因表达、Smadl/5/8蛋白磷酸化水平及Smad结合元件(Smad-binding element,SBE)转录活性.结果显示,DLL1促进BMP2介导MEFs早晚期成骨分化,并上调ALK2等受体的mRNA水平、Smadl/5/8的磷酸化水平及SBE转录活性;与之相对应,dnNotchl和DAPT抑制上述指标.Notch经典靶基因发状分裂相关增强子l(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1,Hey1)可促进BMP2诱导成骨分化,并逆转DAPT对BMP2诱导成骨分化的抑制作用.该研究结果提示,Notch信号促进BMP2诱导MEFs成骨分化,可能是通过激活BMP2/Smads通路实现的,这一过程中Hey1发挥了重要作用.

背景:肝纤维化与肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)相关,TGF-β1在其中起着重要的作用,而BMP7能够拮抗TGF-β1,目前主要研究的是TGF-β/BMPs-Smad信号通路,ALK3属于BMPs的持续活化Ⅰ型受体,在肝纤维化分子研究机制中较少运用.目的:观察大鼠HSCs中稳定表达持续活化型ALK3时Smad1磷酸化及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等表达情况,探讨BMP-7信号转导在肝纤维化发生发展过程中拮抗TGF-β1信号及其抗肝纤维化机制.方法:建立体外培养大鼠HSCs (HSC-T6)持续活化型ALK3的稳定表达细胞株,MTT检测细胞的增殖;RT-PCR检测col1A2等相关分子mRNA水平;Western blotting检测Samd1、E-cadherin、α-SMA、col1A2蛋白表达和Smad1磷酸化;显微镜下观察细胞形态.结果:稳定表达持续活化型ALK3的HSC-T6细胞增殖受到抑制,Smad1磷酸化显著升高,α-SMA,col1A2表达下调,E-cadherin表达上调.结论:BMP-7信号转导通过增强Samd1的磷酸化而拮抗TGF-β1致纤维化作用,抑制大鼠HSCs的活化.

Peptides from Pilose antler aqueous extract (PAAE) have been shown to stimulate the proliferation and differentiation of bone marrow mesenehymal stem cells (BMSCs).However,the underlying molecular mechanisms are not well understood.Here,PAAE was isolated and purified to explore the molecular mechanisms underlying PAAE's effects on BMSCs as well as its osteoprotective effects in ovariectomized rats.Our results showed that PAAE promoted proliferation and differentiation of BMSCs to become osteoblasts by enhancing ALP activity and increasing extracellular matrix mineralization.The trabecular microarchitecture of ovariectomized rats was also found to be protected by PAAE.Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (Quantitative RT-PCR) results suggest that PAAE also increased the expression of osteogenic markers including,alkaline phosphatase (ALP),runt-related transcription factor 2 (Runx2),osteocalcin (OCN),bone morphogenetic protein-2 (BMP-2),and collagen Ⅰ (COL-Ⅰ).Immunoblotting results indicated that PAAE upregulated the levels of BMP-2 and Runx2 and was associated with Smad 1/5 phosphorylation.PAAE A at the concentration of 200 μg·mL-1 showed the strongest effect on proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs after 48 h.Using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS),we identified the molecular weight of PAAE A and found that it is less than 3000 Da and showed several significant peaks.In conclusion,PAAE activates the BMP-2/Smad1,5/Runx2 pathway to induce osteoblastic differentiation and mineralization in BMSCs and can inhibit OVX-indueed bone loss.These mechanisms are likely responsible for its therapeutic effect on postmenopausal osteoporosis.

目的 分析丹皮酚对强直性脊柱炎(AS)小鼠治疗疗效及对Wnt通路与RANKL和Smadl水平的影响.方法 取100只小鼠随机分为模型组、阳性药物组、空白组、丹皮酚组;除空白组外,其余三组均使用100μl蛋白聚糖+100μl弗氏完全佐剂建立强直性脊柱炎模型;造模成功后开始给药,阳性药物组给予柳氮磺吡啶9 mg/kg进行灌胃,丹皮酚组给与丹皮酚3 mg/kg进行灌胃,模型组及空白组给予等体积的蒸馏水.各组每天给药1次,连续进行20 d.在造模前及造模后每一周对小鼠的后足关节炎体征进行评分;采集所有小鼠关节滑膜细胞,采用PCR法检测细胞中RANKL、Smadl水平;采用Westernblot法检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)、骨谷氨酸蛋白(BGP)、DKK1、Wnt5a水平.结果 造模后模型组、阳性药物组、丹皮酚组小鼠关节炎症评分无显著差异(P>0.05),但均高于空白组(P<0.05);治疗1周、治疗2周及治疗3周时阳性药物组及丹皮酚组小鼠后足关节炎体征评分均明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,模型组小鼠RANK、Smadl、Wnt5a水平均高于空白组,ALP、BGP、DKK1水平低于空白组(均P<0.05);阳性药物组、丹皮酚组小鼠RANK、Smadl、Wnt5a水平均明显低于模型组,滑膜细胞中ALP、BGP、DKK1水平明显高于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05);阳性药物组与丹皮酚组小鼠各指标比较无显著差异(P>0.05).结论 采用丹皮酚对AS小鼠治疗后可有效改善小鼠后足炎症评分,并可有效调节Wnt通路,降低滑膜组织中RANKL及Smadl水平.

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病,其特点是骨量低、骨微结构恶化、骨脆性增加、易骨折.为了改善骨质疏松,需要寻找合成代谢和口服药物的副作用最小的替代药物.补骨脂素是从中草药中提取的香豆素衍生物.然而,补骨脂素在成骨细胞功能中的作用及其分子机制尚不清楚.本研究发现,补骨脂素通过上调成骨细胞特异性标志基因(包括icollagen,骨钙素和骨唾液蛋白)的表达,增强碱性磷酸酶的活性,以剂量依赖的方式促进小鼠原代成骨细胞的成骨分化.本研究同时证明补骨脂素能上调BMP2和BMP4基因的表达,提高磷酸化smadl/5/8蛋白水平,激活BMP报告基因(12xbe-oc-luc)的活性以及增强BMP信号直接靶基因osx的表达.BMP2和BMP4基因的缺失消除了补骨脂素对成骨细胞标志基因coll、alp、oc和bsp表达的促进作用.结果 表明,补骨脂素通过激活BMP信号促进成骨细胞分化,提示补骨脂素可能是治疗骨质疏松等骨丢失相关疾病的一种潜在的合成代谢剂.

目的 探讨中等强度运动对去卵巢大鼠骨密度、骨质代谢、骨生物力学及骨形态发生蛋白2(BMP-2)信号通路的影响.方法 将24只成年雌性SD大鼠随机分为假手术组、手术组与运动组,每组8只,假手术组仅切除双侧卵巢周围脂肪组织,手术组、运动组摘除双侧卵巢,摘除卵巢1周后运动组进行中等强度运动训练,共训练12周.12周后,进行股骨骨密度、生物力学、骨代谢、组织学检测,Western blotting检测股骨组织BMP-2、Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix及Smadl/5/8蛋白表达.结果 手术组、运动组血钙、血磷、血抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)浓度高于假手术组(P＜0.05),而运动组上述指标低于手术组(P＜0.05).手术组和运动组骨密度低于假手术组(P＜0.05),而运动组高于手术组(P＜0.05).手术组和运动组骨组织生物力学性能低于假手术组(P＜0.05),而运动组高于手术组(P＜0.05).组织学显示,运动组骨质疏松程度轻于手术组,骨组织内BMP-2表达量多于手术组.手术组和运动组BMP-2、Runx2、Osterix及Smadl/5/8蛋白表达低于假手术组(P＜0.05),而运动组上述蛋白表达高于手术组(P＜0.05).结论 中等强度运动可改善去卵巢大鼠股骨的骨密度、生物力学性能与骨代谢,这一作用可能与BMP-2信号通路有关.