目的:制备抗人神经菌毛素1(human neuropilin 1,HuNRP1)b结构域单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAb),为靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料.方法:运用杂交瘤技术,将HuNRP 1 b结构域重组蛋白(TF-HuNRP1b)免疫BALB/c鼠,共免疫3次,取免疫鼠的脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合,采用间接免疫荧光法(immunofluorescent assay,IFA)筛选稳定分泌抗HuNRP1bmA,以Western blot 、IFA、流式细胞术分析mAb的特异性.以MTT法及小室迁移实验分析mAb抑制血管生成的能力.结果:获得1株稳定分泌抗HuNRP1bmAb的细胞株4F11.Western blot结果表明,本研究所获得的mAb 4F11只与重组HuNRP1b发生反应,与对照蛋白不发生反应;IFA及流式细胞分析结果表明,所获得的mAb能够识别肿瘤细胞MDA-MB-231、HepG2以及人脐静脉内皮细胞表达的天然HuNRP1蛋白;MTT法及小室迁移实验表明,所获得的mAb 4F11具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的能力.结论:成功制备出抗HuNRP1b的mAb,该mAb的获得将为进一步研究HuNRP1的功能及靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料.

作为一种跨膜糖蛋白,神经菌毛素1(NRP1)在轴突导向、血管生成和肿瘤免疫等多种反应过程中发挥重要作用.NRP1高表达于多种肿瘤细胞表面,尤其是上皮细胞肿瘤.阻断NRP1不仅能直接对肿瘤细胞的迁移及肿瘤的发生发展产生抑制作用,而且能够间接抑制肿瘤局部血管的生成与发展,继而影响肿瘤的生长发展.因此,NRP1有望成为抗肿瘤治疗的新突破点.简要探讨NRP1在肿瘤发生发展中的作用,以及以NRP1为靶点治疗恶性肿瘤的相关研究进展.

目的 探讨一级肺爆震伤大鼠早期(＜48h)血管内皮生长因子(VEGF)和神经菌毛素-1(NRP-1)的变化规律及其与肺损伤程度的相关性.方法 利用异径三通管道和定压气动型模拟爆破装置制作大鼠肺爆震伤模型,将40只SD大鼠随机分为对照(C)组和爆震(B)组,其中爆震组包括爆震后1h(B1h)组、爆震后6h(B6h)组、爆震后24h(B24h)组、爆震后48h(B48h)组.检测各组大鼠血清和肺组织VEGF、NRP-1浓度,并进行肺组织损伤严重程度评分.结果 与C组相比,B组血清、肺组织NRP-1浓度增高(P＜0.01),肺组织VEGF浓度下降(P＜0.05);其中B6h组血清和肺组织NRP-1浓度最高,肺组织VEGF浓度最低.相关性分析显示,所有肺爆震伤大鼠肺损伤评分与肺组织NRP-1浓度呈正相关(r=0.429,P=0.014),B6h组肺损伤评分与肺组织VEGF浓度呈负相关(r=-0.769,P=0.013),B48h组肺损伤评分与血清VEGF浓度呈正相关(r=0.777,P=0.012),肺组织湿/干重比值与血清VEGF浓度呈正相关(r=0.687,P=0.030).肺爆震伤基本病理改变则包括肺间质血管断裂、肺泡腔内出血、肺泡上皮细胞和肺泡毛细血管损伤,或伴有炎性细胞浸润.结论 肺爆震伤大鼠早期肺组织和血清NRP-1、VEGF浓度随时间变化,并与肺损伤程度存在相关性.

目的 探究神经菌毛素-1(Neuropilin-1,NRP-1)对舌癌TCa8113细胞增殖、迁移能力、细胞凋亡及对化疗药物敏感性的影响. 方法 以舌癌TCa8113细胞为研究对象,分别使用shRNA方法构建NRP-1敲低TCa8113细胞株和使用NRP-1单克隆抗体两种方法抑制NRP-1功能,通过对比抑制NRP-1功能后TCa8113细胞株与正常TCa8113细胞株,确定NRP-1对TCa8113细胞的增殖、迁移能力、细胞凋亡及对化疗药物敏感性的影响. 结果 成功构建NRP-1敲低TCa8113细胞株(NRP-1-knockdown).NRP-1低表达细胞株和NRP-1单克隆处理抑制NRP-1功能后,细胞的增殖、迁移能力与正常TCa8113细胞株相比均显著降低(P＜0.05),而细胞凋亡及对化疗药物的敏感性增加(P＜0.05). 结论 NRP-1可促进舌癌TCa8113细胞增殖和细胞迁移能力,抑制细胞的凋亡,降低细胞的化疗敏感性.

目的:探究神经菌毛素-1(NRP-1)对急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞的生物学特征的影响.方法:分别采用以下两种方法(构建NRP-1敲低CCRF-CEM细胞株或使用NRP-1单克隆抗体)抑制NRP-1功能,通过对比抑制NRP-1功能后CCRF-CEM细胞株与正常CCRF-CEM细胞株,确定NRP-1对CCRF-CEM细胞的生物学特性的影响.结果:成功构建NRP-1敲低CCRF-CEM细胞株(NRP-1-shRNA).两种方法抑制NRP-1功能后,细胞的增殖、迁移能力均显著降低,而细胞凋亡及对化疗药物的敏感性增加.结论:NRP-1可促进急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞增殖和细胞迁移能力,抑制细胞的凋亡和降低细胞的化疗敏感性.

目的 探究神经菌毛素-1(NRP-1)靶向肽EG3287对人口腔鳞状细胞癌化疗敏感性的影响.方法 首先构建NRP-1敲低的Tca8113细胞株(KD-Tca8113)和BcaCD885细胞株(KD-BcaCD885),采用CCK-8试剂盒检测野生型和NRP-1敲低型细胞株对化疗顺铂的敏感性,计算半数致死剂量(IC50).以乱序肽为对照,评估NRP-1靶向肽EG3287对野生型Tca8113和BcaCD885细胞对顺铂敏感性的影响.结果 流式细胞术结果显示,EG3287肽对NRP-1具有明显的靶向作用;CCK-8结果显示,顺铂对WT-Tca8113、KD-Tca8113、WT-BcaCD885和KD-BcaCD885的IC50分别为(5.32±0.44)、(0.56±0.02)、(4.98-0.57)和(0.64±0.03) μg/ml.野生型细胞IC50明显比NRP-1敲低细胞高(P＜0.01).在IC50剂量的顺铂处理下,EG3287肽组的细胞凋亡率明显较空白对照组和乱序肽组高(P＜0.01).结论 NRP-1表达量与人口腔鳞状细胞癌Tca8113和BcaCD885细胞株对顺铂的敏感性呈负相关,NRP-1靶向肽能明显提高细胞对顺铂的敏感性.

目的 探究肝性脑病(HE)大鼠大脑前额叶皮层、海马CA1、CA3、DG区中脑信号蛋白3A(Sema3A)及受体神经菌毛素(NRP-1)的表达变化及可能的意义.方法 SD大鼠40只随机分为4组:对照组、HE1 d、15 d、30 d组,每组各10只.胆管结扎并辅以乙酸铵灌胃的方法 制备慢性HE(C型)大鼠模型,进行行为学、神经病学改变的检测;ELISA检测大鼠血清中血氨及其他生化指标;HE染色观察大鼠肝脏和脑组织形态学变化;Real-time PCR检测各脑区Sema3A、NRP-1 mRNA的表达;免疫组化、Western Blot分别检测大脑皮层、海马CA1、CA3、DG区中Sema3A及NRP-1蛋白的表达变化.计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验.结果 4组间神经反射等级、血氨、HE等级均有统计学差异(F值分别为76.39、417.07、71.56,P值均<0.001),与对照组比较,HE 1 d、15 d、30 d组神经反射得分、血氨、HE等级均明显升高(P值均<0.05).4组间TBA、Alb、TBil、AST、ALT、ALP比较差异均有统计学意义(F值分别为1022.61、171.56、685.18、421.01、675.20、2405.04,P值均<0.001),与对照组相比,HE 1 d、15 d、30 d组Alb水平明显降低(P<0.05),其余指标明显升高(P值均<0.05).病理学结果 显示,与对照组相比,造模后大鼠肝脏出现不同程度的变性坏死,炎细胞浸润,大脑前额叶皮层及海马CA1、CA3、DG区体等部位观察到神经细胞不同程度的肿胀、破裂、排列紊乱等病理征象.4组间Sema3A、NRP-1 mRNA比较差异均有统计学意义(Sema3A mRNA:F值分别为273.83、158.84、103.59、128.90,P值均<0.001;mRNA:F值分别为88.78、173.02、156.44、289.09,P值均<0.001);与对照组比较,HE 1 d、15 d、30 d组大脑前额叶皮层、海马CA1、CA3、DG区中Sema3A、NRP-1 mRNA相对表达量均较高(P值均<0.05).建模后Sema3A、NRP-1蛋白表达水平上调,免疫组化显示,HE组大鼠前额叶皮层和海马CA1、CA3、DG区Sema3A及NRP-1呈阳性染色.Western Blot显示,4组间大脑前额叶皮层及海马CA1、CA3、DG区Sema3A、NRP-1蛋白表达差异均有统计学意义(Sema3A:F值分别为835.14、774.16、282.60、856.29,P值均<0.001;NRP-1:F值分别为876.59、472.48、402.36、207.47,P值均<0.001);与对照组相比较,HE 1 d、15 d、30 d组大脑前额叶皮层及海马CA1、CA3、DG区内Sema3A、NRP-1蛋白表达均明显升高(P值均<0.05).结论 Sema3/NRP-1在慢性HE大鼠脑组织内表达上调,参与HE神经损伤的病理生理过程.

目的 构建一种具有神经菌毛素-1(Neuropilin-1,NRP-1)靶向性自组装多肽作为载药系统,与柔红霉素自主装成纳米粒.评估其对急性淋巴性白血病细胞增殖和细胞周期的影响.方法 自主装多肽序列为EEDEEDEEDRPA-KPAR(简写为P16),其中N端EEDEEDEED为带负电的氨基酸序列,可与带正电的柔红霉素(Daunorubicin,DRN)结合,C端RPAKPAR为NRP-1靶向肽序列.自组装后形成的纳米复合物分别用透射电镜、马尔文粒度仪进行表征.共聚焦显微镜与流式细胞术检测纳米复合物的体外NRP-1靶向性.全自动细胞计数仪评估该复合物对人急性淋巴细胞性白血病CCRF-CEM细胞增殖的影响.最后利用流式细胞术评估纳米复合物对CCRF-CEM细胞周期的影响.结果 自主装多肽可与柔红霉素自组装成粒径约为100 nm的P16/DRN纳米复合物.高效液相色谱分析P16/DRN纳米复合物中,DRN的浓度为0.83 mmol/ml.共聚焦显微镜提示,P16/DRN纳米复合物具有NRP-1靶向能力.全自动细胞计数仪和流式细胞术结果提示,P16/DRN纳米复合物能显著抑制CCRF-CEM细胞的增殖,促进细胞凋亡.结论 构建的Neuropilin-1靶向性自组装多肽可提高柔红霉素对人急性淋巴细胞性白血病CCRF-CEM细胞的化疗效果.

目的:探究Neuropilin-1表达对口腔鳞状细胞癌放疗敏感性的影响.方法:挖掘基因表达汇编(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库,筛选出口腔鳞状细胞癌放疗耐受的差异基因,再利用癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库探讨关键基因在口腔鳞状细胞癌中的表达及对生存率的影响.通过构建敲低、过表达细胞系,探讨该基因对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖及放疗敏感性的影响.结果:GEO数据库筛选出Neuropilin-1为口腔鳞状细胞癌的上调基因,TCGA数据库结果分析,Neuropilin-1在口腔鳞状细胞癌中表达量较正常口腔组织高(P＜0.01),差异有统计学意义.且在口腔鳞状细胞癌中Neuropilin-1的表达量与肿瘤恶性程度正相关.细胞功能学研究提示,Neurop'ilin-l表达能促进Tca8113细胞的增殖和降低Tca8113细胞对射线的敏感性.结论:Neuropilin-1与口腔鳞状细胞癌的发生发展,放疗耐受相关,是逆转口腔鳞状细胞癌放疗不敏感的潜在靶点.

目的:探究沉默神经菌毛素-1(NRP-1)对宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞生长、自噬和移植瘤裸鼠存活的影响.方法:构建NRP-1慢病毒载体转染至SiHa细胞,将细胞分为4组:Control组、shRNA-NC组、NRP-1-shRNA1组和NRP-1-shRNA2组.RT-qPCR法检测NRP-1 mRNA水平,克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Westernblotting法检测NRP-1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-Myc、Beclin1、ATG7、微管相关蛋白1轻链3(LC3)I及LC3II蛋白表达水平.将转染NRP-1-shRNA1的SiHa细胞皮下注射裸鼠,将裸鼠随机分为Control组和NRP-1-shRNA1组,检测肿瘤重量、裸鼠存活率、凋亡和自噬蛋白表达.结果:与Control组和shRNA-NC组比较,NRP-1-shRNA1组、NRP-1-shRNA2组NRP-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低,克隆形成率显著降低,细胞凋亡率显著升高,Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值显著升高,c-Myc蛋白水平显著降低,ATG7蛋白水平和LC3II/LC3I比值显著升高(均P<0.05).裸鼠实验结果表明,NRP-1-shRNA1组肿瘤重量显著降低,裸鼠存活率、细胞凋亡率、Caspase-3阳性表达率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高(均P<0.05).结论:沉默NRP-1能抑制宫颈鳞状细胞癌Si-Ha细胞增殖,促进细胞凋亡和自噬,并促进移植瘤裸鼠存活.