目的:分析整合酶(IN)区主要耐药突变对HIV-1 CRF01_AE毒株耐药的影响，并比较与B亚型毒株的差异。方法:根据美国斯坦福大学HIV耐药数据库选择7个IN区突变或联合突变(T66K、F121Y、Q148K、N155H、G118R、R263K、Q148K/N155H)，通过无缝克隆同源重组及点突变的方法引入到HIV-1 B亚型感染性克隆pNL4-3和CRF01_AE感染性克隆pGX002的IN区，转染293T细胞包装病毒，在MT2细胞上扩大培养并测定感染性滴度。检测4种整合酶链转移抑制剂(INSTIs)，拉替拉韦(RAL)、埃替拉韦(EVG)、多替拉韦(DTG)、比昔格韦(BIC)对14株突变病毒的半抑制浓度(IC 50)及其与野生型病毒相比提高的倍数。 结果:成功构建携带7个IN区突变或联合突变的B亚型和CRF01_AE质粒，包装获得14株重组病毒，感染性滴度为10 4~10 6半数组织细胞感染剂量(TCID 50)/ml，在MT2细胞高效复制，上清液中HIV-1 P24抗原浓度可达830~2 700 ng/ml。5个突变或突变组合(T66K、F121Y、Q148K、N155H、Q148K/N155H)均可导致CRF01_AE和B亚型毒株对RAL和EVG高度耐药，与野生病毒相比IC 50分别提高200倍和2 000倍以上，相同突变导致RAL和EVG对CRF01_AE的IC 50提高的倍数均显著低于B亚型( P<0.01)。Q148K/N155H突变导致B亚型和CRF01_AE对DTG和BIC高度耐药，IC 50提高50倍以上，其他突变对DTG和BIC的药物敏感性几乎无影响。 结论:构建了基于CRF01_AE和B亚型的14株携带不同INSTI耐药突变的HIV-1毒株，5个突变可导致对RAL和EVG的高水平交叉耐药，同一突变导致B亚型毒株耐药程度显著高于CRF01_AE毒株。Q148K和N155H突变组合可导致DTG和BIC的高度耐药，表明DTG和BIC耐药的遗传屏障高，可有效抑制携带INSTI耐药突变的毒株，且无明显的亚型耐药差异。

目的:构建和鉴定表达新型冠状病毒（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）Omicron株刺突蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的重组4型腺病毒。方法:使用重叠延伸PCR和无缝克隆构建增强型绿色荧光蛋白和RBD双顺反子表达盒，将PCR得到的ccdB片段和pBR322-Ad4质粒进行同源重组获得中间质粒pBR322-Ad4-ccdB，使用 PacI和 SpeI酶切质粒pBR322-Ad4-ccdB后回收载体片段，回收片段与双顺反子表达盒在 E.coli GB08Red中同源重组获得重组质粒pBR322-Ad4-RBD，用 AsiSI线性化后转染HEK293T细胞获得重组腺病毒Ad4-RBD，RT-PCR验证RBD蛋白的转录，Western blot验证重组腺病毒中RBD蛋白的表达。 结果:重组腺病毒Ad4-RBD的滴度达到5×10 8 PFU/mL，并能在细胞中稳定表达外源基因。 结论:成功构建了表达SARS-CoV-2 Omicron株RBD蛋白的重组4型腺病毒，为SARS-CoV-2 Omicron株疫苗的研发提供了科学有效的依据。

目的:诺如病毒（norovirus，NoV）是导致人类急性胃肠炎的主要病原体之一，目前仍没有获批上市的NoV疫苗，开发安全有效且便于推广的NoV疫苗具有重要意义。本研究基于乳酸菌表达系统构建在体外表达GⅡ.2型人诺如病毒（human norovirus，HuNoV）主要衣壳蛋白（viral protein 1，VP1）的重组乳酸乳球菌，并评价其诱导机体产生黏膜免疫和体液免疫的能力。方法:将HuNoV GⅡ.2型VP1基因片段无缝克隆至乳酸菌表达系统中，体外诱导表达目的蛋白VP1，并通过正交试验优化蛋白表达条件。对小鼠进行口服免疫后通过ELISA方法测定其血清和组织中的免疫因子水平。结果:构建了一株针对HuNoV GⅡ.2型的新型重组乳酸乳球菌疫苗，口服免疫后可诱导小鼠产生NoV特异性IgG和IgA，并诱导产生黏膜免疫系统的主要效应分子sIgA。结论:本研究构建的口服乳酸菌疫苗能够诱导小鼠产生针对NoV的先天性和获得性免疫，并产生对应的免疫分子。与被广泛用于研究的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗相比，此口服疫苗还具有制备快捷、成本更低、运输方便的优势。

目的 从毛萼香茶菜中挖掘Ⅱ型二萜合酶并进行功能鉴定.方法 利用转录组测序和生物信息学分析技术从毛萼香茶菜的根、茎、叶、顶芽 4 种组织中挖掘Ⅱ型二萜合酶候选基因,通过 RT-PCR 方法获取候选基因 cDNAs,运用无缝克隆技术构建携带候选基因的表达载体,并基于大肠杆菌异源表达体系及 GC-MS 测定分析技术进行二萜合酶基因的催化功能鉴定.结果 分别从毛萼香茶菜的根、茎、叶、顶芽组织中提取总RNA,经过转录组测序和生物信息学分析获得 4 个Ⅱ型二萜合酶候选基因 IeTPS1、IeTPS2、IeTPS3 和 IeTPS4.利用大肠杆菌异源表达体系对其中的 IeTPS1 和 IeTPS4基因进行功能验证,发现 IeTPS1 能够催化底物香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)生成对映-柯巴基焦磷酸(ent-CPP),命名为 IeCPS4;IeTPS4 能够催化底物 GGPP 生成柯巴基焦磷酸(normal-CPP),命名为 IeCPS5.结论 从毛萼香茶菜中筛选并鉴定了两个新的Ⅱ型二萜合酶基因 IeCPS4 和 IeCPS5,其中 IeCPS5 是首个从毛萼香茶菜中发现的专一合成 normal-CPP 的二萜合酶基因,这不仅丰富了毛萼香茶菜的二萜合酶种类,而且为毛萼香茶菜二萜化合物生物合成途径的解析奠定了坚实基础.

目的 构建表达宫颈癌抗原的单增和绵羊李斯特菌平衡致死系统,并研究其基本生物学特性,为宫颈癌免疫治疗提供参考数据.方法 将实验室已有的HPV16型E6E7融合蛋白抗原基因盒通过无缝克隆的方式连接到含有营养基因dal的回补质粒pCWgfp-LM dal-Amp上,并用asd营养基因替换回补质粒的氨苄(ampicillin,Amp)抗性基因,转化大肠杆菌受体菌DH5аΔasd,利用营养筛选得到表达宫颈癌抗原同时不具有Amp抗性的回补质粒pCWgfp-E6E7-LM dal-Ampfree,将其分别电转两株敲除了毒力基因actA、plcB和营养基因dal、dat的减毒李斯特菌营养缺陷株LMΔdd和LIΔdd中,得到表达宫颈癌抗原基因的单增和绵羊李斯特菌平衡致死系统.观察其体外生长情况,利用蛋白印迹实验检测蛋白表达情况,PCR检测回补质粒pCWgfp-E6E7-LM dal-Ampfree的体外传代稳定性,通过基本生化反应测定和溶血实验研究其基本生物学特性.结果 成功构建表达宫颈癌抗原的两种李斯特菌平衡致死系统;目标蛋白能够在李斯特菌平衡致死系统中成功表达;表达宫颈癌抗原的回补质粒能够在李斯特菌平衡致死系统中稳定存在;表达宫颈癌抗原的李斯特菌平衡致死系统较李斯特菌营养缺陷株相比明显恢复生长;生化反应测定结果显示,表达宫颈癌抗原的李斯特菌平衡致死系统与李斯特菌减毒株绝大多数生化反应保持一致;添加了宫颈癌抗原基因的李斯特菌平衡系统仍能保持溶血能力,但略逊于未表达宫颈癌抗原的李斯特菌平衡致死系统和李斯特菌减毒株.结论 成功构建表达宫颈癌抗原基因的两种李斯特菌平衡致死系统,其在体外能正常生长,回补质粒能在体外稳定存在,基本生化特性及溶血能力变化不大,可作为宫颈癌治疗性疫苗候选株进一步研究.

AAlagille综合征Alagille综合征误诊为胆道闭锁1例并文献复习(符高佳,林道炯),(7):(773)埃博拉病毒病 埃博拉病毒病——病死率极高的人畜共患病(殷启凯,梁国栋),(1):(1)艾滋病 武汉市男男性行为人群艾滋病非职业暴露后预防用药需求及影响因素(刘玉新,孔德广,王夏,等),(2):(167)按蚊 中国传疟媒介按蚊幼虫防制的主要实践及基本策略(王海防,周正斌,肖宁,等),(12):(1294)埃及伊蚊 氟虫腈处理埃及伊蚊幼虫的转录组学分析(王凯旋,索鹏辉,赵培真,等),(5):(462)利用无缝克隆方法构建埃及伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A双向启动子苏云金芽孢杆菌穿梭载体(马晨昕,张莹心,刘思寒,等),(11):(1141)

目的 构建表达dsRNA的双向启动子以及靶基因AaCPR100A的大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315-AaCPR100A.方法 以苏云金芽孢杆菌pSVP27A质粒为模板通过PCR扩增苏云金芽孢杆菌Cry3A正向启动子Pro-1(+);以埃及伊蚊RNA反转为cDNA为模板,扩增靶基因AaCPR100A;将大肠-苏云金穿梭载体pHT315质粒经Hind Ⅲ和Sal Ⅰ双酶切线性化;按照转录方向将正向启动子与靶基因通过无缝克隆插入穿梭载体pHT315中;以生物合成的含有Cry3A反向启动子序列的质粒为模版,经PCR克隆扩增Pro-1(-)反向启动子;将含有正向启动子与靶基因的中间载体通过EcoRⅠ限制性酶切酶线性化,按转录方向在靶基因下游通过无缝克隆插入反向启动子.结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,正向启动子、靶基因AaCPR100A和反向启动子PCR产物条带清晰,质量良好,可用于无缝克隆实验;经无缝克隆连接双向启动子以及靶基因片段后,对含有重组载体pHT315-AaCPR100A的重组质粒进行PCR验证,在重组载体中成功扩增正向启动子、靶基因片段以及反向启动子,经核苷酸测序验证双向启动子序列以及靶基因序列测序结果与序列比对结果基本一致,符合构建载体元件的要求,证明重组载体构建成功.结论 本研究利用无缝克隆技术成功构建含有双向启动子以及靶基因的重组穿梭载体,为构建表达伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A dsRNA的苏云金芽孢杆菌工程菌奠定基础.

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已广泛用于植物基因功能研究,以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)为载体的沉默体系介导大豆基因沉默效率有待明确,采用无缝克隆技术构建TRV-VIGS沉默体系,探索不同接种方法对大豆靶基因在不同组织间的沉默效率,为大豆基因功能研究提供依据.以八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,GmPDS)及泛素连接酶(GmATL3)基因为靶基因,将含有pTRV1 和重组载体菌液采用注射、灌根(agroinoculation)、注射与灌根相结合 3 种方法分别接种大豆中黄 13,接种 28 d观察沉默表型现象,并使用RT-qPCR技术检测根部与叶部基因相对表达量,明确不同方法沉默效果.注射接种的大豆叶边缘及叶内出现黄化褪绿,灌根接种与注射加灌根接种的叶片表面出现褪绿斑点及褶皱褪绿表型.RT-qPCR结果表明,3 种接种方法对沉默GmPDS效果接近 100%;注射接种对GmATL3 的沉默效率在叶部为 80%-95%,根部为 40%-60%;灌根与注射加灌根接种,根部沉默效率为 70%-90%,叶部沉默效率为 15%-50%.不同接种方法产生不同程度沉默表型,且对不同内源基因沉默效率不同.接种方法对不同组织沉默效率存在差异,注射方法对叶片沉默效率最高,注射加灌根结合的方法对根部沉默效率最高.

目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率.方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kan')连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candidalipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP.结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4％,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1％,表明启动子替换能促进C.tropicalis 1798对甘油的吸收利用.此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7％.结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率.

N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶.本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48％)的N-聚糖酶基因(OsPNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体pPICZ(α)A-OsPNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和HisTrap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg.SDS-PAGE结果显示,纯化的OsPNGase A为单一条带且与预期分子量一致.OsPNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F.OsPNGase A反应的最适pH和温度分别为pH 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性.水稻OsPNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGaseA的大量制备奠定了基础.