目的 筛选出宿主细胞中与纳尔逊湾呼肠孤病毒(NBV)非结构蛋白σNS互作的RNA结合蛋白并分析其生物信息学功能.方法 本研究通过构建NBV σNS真核表达载体pEF-HA-MB-S3,验证正确后转染HEK293T细胞,所得的细胞蛋白裂解液经RNase A处理后,利用免疫沉淀富集σNS结合蛋白,经LC-MS/MS质谱分析技术鉴定分析互作蛋白,并且借助相关生信工具挖掘蛋白性质和具体功能.结果 本实验成功筛选出32个与NBV σNS蛋白存在互作的候选RNA结合蛋白;生物分析结果显示,这些蛋白主要定位于细胞质与细胞核中,并且主要参与细胞代谢、生物调控、病毒翻译与转录等生物学过程.结论 本研究初步分析与NBVσNS互作的RNA结合蛋白功能,为深入研究σNS蛋白在NBV生命周期中的作用机制奠定基础.

目的 制备纳尔逊海湾病毒(NBV)S3多克隆抗体.方法 首先将构建好的Pris His MB-S3重组基因质粒,转化到大肠杆菌(E coil) BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.镍柱亲和层析法纯化目的蛋白以获得大量融合重组蛋白,以此为抗原免疫大鼠制备抗S3多克隆抗体并进行鉴定.结果 Pris His MB-S3蛋白的相对分子质量(Mr)约39 000,以包涵体形式存在,通过免疫大鼠成功制备出NBV S3多克隆抗体.间接ELISA测定抗体效价达1∶64 000.间接免疫荧光实验证明S3蛋白成功在细胞内表达并以颗粒状分布在细胞质内.结论 成功获得高反应性和高特异性的S3蛋白多克隆抗体.

目的 研究呼肠孤病毒科纳尔逊海湾病毒非结构蛋白 μNS与 σNS在感染及转染细胞中的表达和分析.方法 在感染细胞中,通过免疫荧光方法 在共聚焦显微镜下观察 μNS蛋白的表达,以及 μNS和σNS共定位情况;同时通过转染质粒的方法 观察非感染细胞中μNS和σNS的表达及共定位情况.结果 μNS蛋白在感染细胞和单独转染质粒细胞中都形成包涵体样结构,σNS和 μNS蛋白相互作用,σNS和μNS蛋白共定位存在于包涵体样结构内.结论 μNS不仅可以在病毒感染细胞中,而且可以在单独转染的细胞中形成包涵体样结构,σNS可以与μNS相互作用,共定位于感染和转染细胞的包涵体样结构中.

目的 建立呼肠孤病毒空斑检测方法,为进一步研究该病毒奠定基础.方法 通过Western Blot、免疫荧光检测纳尔逊海湾正呼肠孤病毒Miyazaki病毒株感染L929细胞和BSR细胞情况,病毒RNA水平凝胶电泳验证Miyazaki病毒株核酸成分.建立呼肠孤病毒空斑检测方法,计算病毒滴度.结果 Miyazaki病毒株能成功感染L929细胞和BSR细胞,水平凝胶电泳验证病毒株核酸成分正确,病毒株感染的L929细胞出现空斑,计算得出病毒滴度结果为2.2×108 PFU/mL.结论 呼肠孤病毒空斑检测方法成功建立,该方法可以形成清晰可见的空斑,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究呼肠孤病毒提供帮助.

目的:检测非结构蛋白μNS和σNS之间的相互作用及其结合区域,阐明纳尔逊湾正呼肠孤病毒(NBV)的致病机制.方法:采用Lipo3000转染试剂将pCAG M3和pEFHAσNS质粒分别和共同转染至BHK细胞中,免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞中的定位和分布;用NBV感染BHK细胞,采用Western blotting法检测μNS和σNS蛋白在感染细胞中的表达.构建σNS蛋白N末端10～60个氨基酸(aa)残基缺失的质粒,免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞内共定位的结合区域,酵母双杂交实验验证μNS和σNS蛋白相互作用的结合区域.结果:亚细胞定位显示,NBV的μNS蛋白在无其他病毒蛋白的情况下会形成包涵体结构,而σNS蛋白弥散地分布在整个细胞质中.Western blotting检测证实μNS和σNS蛋白在感染细胞中表达.采用偶联抗体进行免疫染色,共聚焦显微镜下观察到μNS和σNS蛋白共定位于细胞质中.利用酵母双杂交实验检测到与μNS蛋白相互作用的σNS蛋白的基本区域位于σNS蛋白N末端区域的60个aa残基区域内.结论:NBV自噬相关蛋白σNS蛋白可以通过与μNS蛋白相互作用而共同表达于病毒包涵体中,σNS蛋白与μNS蛋白的结合区域位于σNS蛋白N末端的60个aa残基区域内.