目的:拯救肠道病毒A组71型(enterovirus group A type 71, EV-A71)VP1蛋白突变型毒株(Val147→Ala)，探究该位点对病毒毒力的影响。方法:以SDLY107构建的质粒pMD19-T-EGFP-107为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建重组质粒pMD19-T-EGFP-107(VP1-1)，重组质粒转染至BSR-T7/5细胞，转染产物在RD细胞中连续传代3次，成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，qRT-PCR检测病毒复制力，细胞增殖(CCK-8)和乳酸脱氢酶(LDH)实验检测病毒致细胞损伤力。结果:重叠融合PCR扩增得到目的片段，大小约3.4 kb；重组质粒经双酶切鉴定，测序验证突变成功。重组质粒转染BSR-T7/5细胞24 h观察到明显荧光，所收培养物上清接种至RD细胞24 h观察到明显荧光。qRT-PCR检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞中的复制能力弱于强毒株SDLY107( t＝9.58， P<0.001)。CCK-8、LDH实验检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞( t＝106.60， P<0.001； t＝39.88， P<0.001)、SH-SY5Y细胞( t＝18.72， P<0.001； t＝19.09， P<0.001)中的致细胞损伤力均明显弱于强毒株SDLY107。 结论:成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，证实VP1蛋白第147位氨基酸位点突变可降低病毒的复制力及其致细胞损伤力，为进一步研究VP1蛋白在EV-A71致病机制中的作用提供基础。

目的:建立狂犬病病毒CVS-11以肌肉注射或脑内注射方式攻毒的BALB/c小鼠动物模型。方法:将由BSR细胞传代繁殖的滴度为2.7×10 7 FFU/ml的CVS-11毒株进行10 －1～10 －7倍系列稀释，分别以肌肉或脑内注射的方式对4周龄的雌性BALB/c小鼠进行攻毒，观察小鼠发病死亡情况，并对所有攻毒小鼠的脑组织进行直接免疫荧光试验(direct fluorescent assay, DFA)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测以确定小鼠死因。确定不同攻毒方式下小鼠的半数致死量(median lethal dose，LD 50)，建立小鼠模型。根据已建立的小鼠模型，评估4种国内市售狂犬病疫苗对CVS-11暴露后小鼠的免疫保护效果。 结果:BALB/c小鼠脑内攻毒后于第6～12天开始出现典型的神经症状并死亡，其LD 50为18.3/0.1 ml；肌肉注射攻毒的小鼠在第8～15天出现临床症状并死亡，LD 50为2.7×10 5/0.1 ml。DFA检测结果显示，所有死亡小鼠脑组织印片中均出现特异性黄绿色荧光，RT-PCR检测结果显示所有的扩增产物均出现大小约250 bp的明亮条带。以上结果提示狂犬病病毒感染是小鼠的致死原因。4种不同的市售狂犬病疫苗在无免疫球蛋白应用情况下的保护效果试验显示，接种其中1种疫苗暴露后小鼠的存活率为50%，接种其他3种疫苗小鼠的存活率为30%。以上结果表明，在无狂犬病被动免疫制剂使用的情况下，所选用的4种狂犬病疫苗对经CVS-11暴露后的小鼠提供了部分保护作用。 结论:本研究建立了狂犬病病毒CVS-11不同攻毒方式下的BALB/c小鼠动物模型，为狂犬病及狂犬病疫苗的相关研究提供了一个技术平台。

目的 拯救携带IP10基因的重组新城疫病毒(rNDV-IP10).方法 用重组酶将IP10基因插入rNDV质粒,将重组BRN-FL-IP10质粒和辅助质粒共转染稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-7细胞进行病毒拯救.用鸡红细胞检测重组病毒的血凝效价;用NDV及rNDV分别感染鸡胚成纤维细胞,检测病毒的生长动力学;用NDV及rNDV分别感染乳仓鼠肾细胞(BHK-2细胞),间接免疫荧光技术检测IP10蛋白的表达;将rNDV-IP10重组病毒感染人肝癌细胞低转移株(MHCC-97L),Western blotting法检测细胞中IP10蛋白表达.结果 鸡红细胞血凝效价为阳性,重组病毒rNDV-IP10的生长特征与亲本NDV相比相似.感染了rNDV-IP10的BHK-2细胞具有特异性荧光,感染了rNDV-IP10的MHCC-97L细胞具有特异性条带.结论 成功拯救出能够表达IP10基因的重组病毒rNDV-IP10.

目的:运用代谢组学方法探究黄芩及其拆分组分对寒、热证模型大鼠能量代谢的影响,寻找潜在干预靶点及其代谢途径,通过整合分析探讨其作用机制并对各组分的药性进行归属,为黄芩合理用药及临床应用提供重要依据.方法:基于代谢组学角度对黄芩及其拆分组分进行药性归属,以及与能量代谢有关的药效学评价.采用Unify软件对各组分中化合物进行鉴定,并通过高效液相色谱法(HPLC)、超高压液相色谱-飞行时间质谱技术(UPLC-TOF-MS)与MarkerlynxTM软件进行互不交叉验证.通过UPLC-TOF-MS技术对黄芩干预的寒、热证大鼠尿液进行代谢组学研究.结果:代谢组学结果显示,寒证模型大鼠鉴定出2-氨基马来酸等10个与能量代谢相关的生物标志物.其中黄芩全成分可减慢基因转录进程和促进色酪氨酸代谢过程.黄芩多糖可抑制谷胱甘肽代谢、能量代谢及三羧酸循环.黄芩苷元作用不明显.黄芩苷类能够对能量代谢起到显著抑制作用.热证模型大鼠鉴定出色胺等10个与能量代谢相关的生物标志物.其中黄芩全成分可减慢核酸代谢和细胞代谢过程;黄芩多糖除了与全成分有相似的作用外,还能减慢葡萄糖代谢;黄芩苷元能抑制核酸代谢与糖代谢;黄芩苷类能够抑制核酸代谢.结论:黄芩对寒、热证模型大鼠能量代谢作用呈现抑制的趋势,并且干预靶点不同,证明在其4段不同的药效物质基础组分中,全成分、苷类、苷元、多糖均为寒性.

[目的]构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒, 分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力.[方法]采用融合PCR技术, 在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失, 构建全长重组质粒.全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系, 拯救标记病毒.RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒.噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性, 并用实验室开发的针对3A优势表位 (AEKNPLE) 的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物.[结果]成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒, 3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线.3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物.[结论]本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株, 用于我国未来口蹄疫A型的有效防控.

目的 构建含有人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)核蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和转录延长/终止抑制因子(transcription elongation/antitermination factor M2-1,M2-1)蛋白编码基因的表达载体,并转染BSRT7/5细胞,鉴定蛋白的表达.方法 根据hRSV兰州株(LZ01/09)的N、P和M2-1基因序列设计3对特异性引物,以pcDNA-N、pcDNA-P和pcDNA-M2-1质粒为模板,PCR扩增N、P和M2-1基因片段,与pGEM-T载体连接,构建亚克隆载体;再通过体外酶切连接将内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)序列克隆至pRSV7载体T7启动子表达盒基因的上游,构建基本表达载体p7IK;通过酶切连接构建表达载体p7IK-N、p7IK-P和p7IK-M2-1,转染BSR T7/5细胞,采用Western blot法鉴定蛋白的表达.结果 亚克隆载体、基本表达载体和表达载体经酶切及测序验证均构建正确;Western blot可检测到N、P和M2-1蛋白的特异性条带.结论 成功构建了含有N、P和M2-1编码基因的表达载体,经BSR T7/5细胞鉴定3种蛋白成功表达,为进一步应用反向遗传学技术拯救RSV及研发RSV减毒活疫苗奠定了基础.

目的 建立人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)微型基因组拯救系统,并鉴定其功能.方法 利用包含T7启动子、锤头状核酶、hRSV的前导序列、基因起始信号、非编码区、多克隆位点、基因终止信号、尾随序列、丁肝核酶、T7终止子的基本载体pRSV1和pRSV2,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因构建微型基因组质粒pRSV1-eGFP和微型反基因组质粒pRSV2-eGFP.以pcDNA3.1(+)为表达载体,与优化后的RSV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、聚合酶大片段(L)和转录延长/终止抑制因子(M2-1)基因序列构建辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L和pcDNA-M2-1.将微型基因组质粒或微型反基因组质粒通过单转染、与RSV共感染或与辅助质粒共转染至表达T7 RNA聚合酶(T7 RNP)的BSR-T7/5细胞,荧光显微镜或流式细胞仪观察eGFP的表达,并鉴定微型基因组的功能及辅助蛋白的生物学活性.结果 微型基因组质粒、微型反基因组质粒和4个辅助质粒经双酶切及测序证明构建正确;微型基因组质粒通过先感染后转染或与辅助质粒共转染,观察到eGFP的表达,证实了微型基因组的功能活性;缺乏N、P或L蛋白,检测不到eGFP的表达;缺乏M2-1蛋白,eGFP的表达量降低.结论 成功建立了RSV微型基因组拯救系统,并证实了其拯救功能,为利用反向遗传学手段拯救重组RSV,研发RSV减毒活疫苗奠定了基础.

目的 建立呼肠孤病毒空斑检测方法,为进一步研究该病毒奠定基础.方法 通过Western Blot、免疫荧光检测纳尔逊海湾正呼肠孤病毒Miyazaki病毒株感染L929细胞和BSR细胞情况,病毒RNA水平凝胶电泳验证Miyazaki病毒株核酸成分.建立呼肠孤病毒空斑检测方法,计算病毒滴度.结果 Miyazaki病毒株能成功感染L929细胞和BSR细胞,水平凝胶电泳验证病毒株核酸成分正确,病毒株感染的L929细胞出现空斑,计算得出病毒滴度结果为2.2×108 PFU/mL.结论 呼肠孤病毒空斑检测方法成功建立,该方法可以形成清晰可见的空斑,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究呼肠孤病毒提供帮助.

探究番茄4CL基因家族的基本理化性质、分子进化特性和其在不同浓度氮素下的表达模式.对番茄4CL基因家族成员进行全基因组鉴定,采用生物信息学方法对其进行分析,并在不同浓度氮素处理下进行qPCR验证.在番茄中共鉴定出6个4CL基因家族成员,全部成员均为稳定蛋白,有5个成员呈酸性,编码的氨基酸数在538-957之间,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构除Sl4CL04以5bsw.1.A为模型,其他成员均以5bsr.1.A为模型.番茄4CL基因家族内含子数量在5-11之间,12个Motif在Sl4CL中排序及位置都非常保守,具有较高的同源性.启动子顺式作用元件分析发现MYB作用元件的分布最多,在不同浓度氮素处理下,6个基因表达量均有显著差异.对Sl4CL03构建过表达载体,亚细胞定位结果显示位于过氧化物酶体、叶绿体和细胞质.番茄4CL家族进化具有保守性和特异性,能够在氮素处理时进行相关机理调节.

目的 对实验室研发的1株狂犬病减毒株CTN181-3的致病性和基因型特性进行研究.方法 用小鼠脑内、口腔接种法和金黄地鼠口腔接种法测定病毒毒力.将病毒通过乳鼠脑内、豚鼠颌下腺和细胞连续传多代,测定传代后病毒的遗传稳定性.对CTN181-3进行全基因组测序,并与其亲本株进行对比分析.结果 CTN181-3对实验动物毒力高度减弱,对3周龄小鼠无论脑内或口腔接种均无致病性,对2周龄小鼠也表现出脑内低毒力;口腔接种8周龄金黄地鼠亦无发病死亡.遗传稳定性方面,经1～3 d龄乳鼠脑内连续传5代或豚鼠颌下腺传4代,传代增殖后的病毒滴度虽高达7.10 lg PFU/mL或7.63 lg PFU/mL,对小鼠脑内接种仍保留无致病力的弱毒特性;在BSR细胞和Vero 细胞上分别传10代,表型特性稳定.全基因组测序结果分析显示CTN181-3株与国内近年来分离株的同源性高于其他疫苗株与国内分离株的同源性.CTN181-3株与其原始的亲本株CTN-1比较,发生8个氨基酸位点的突变,其中G276 L→V和L1496 M→W氨基酸的突变在CTN181株未发生,为CTN181-3株所特有.因此,这2个位点的氨基酸突变应该是CTN181-3株比CTN181株毒力更弱、遗传稳定性更高的分子基础.结论 CTN181-3株的神经毒力高度减弱,毒力稳定,是一种很有应用前景的动物用狂犬病候选疫苗株.