目的:观察敲低热休克蛋白B8 （HspB8）对鼠视神经钳夹（ONC）后视网膜神经节细胞（RGC）及视网膜功能的影响。方法:构建敲低HspB8的重组腺相关病毒（AAV) 2-小发夹HspB8 （shHspB8）-绿色荧光蛋白（GFP）。雄性C57BL/6J小鼠66只随机分为正常对照组、ONC组、AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2组，分别为10、20、16、10、10只，双眼均作为实验眼。建模后3、7 d，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠视网膜HspB8蛋白相对表达变化；GFP免疫荧光染色确定AAV2-shHspB8-GFP转染情况。建模后5 d，视动反应（OMR）、暗适应全视野闪光视网膜电图（ff-ERG）检测各组小鼠视敏度、振荡电位（OPs ）、明视负向反应（PhNR）振幅和潜伏期；视网膜铺片计数各组小鼠RGC。采用Mann-Whitney U检验、独立样本 t检验、Welch法校正 t检验、单因素方差分析、Bonferroni t检验对数据进行统计分析。 结果:与正常对照组比较，ONC3组小鼠视网膜中HspB8蛋白相对表达量明显增加，差异有统计学意义（ F=43.63， P<0.01 ）。与正常对照组比较，ONC5组小鼠视敏度明显降低，差异有统计学意义（ P<0.01）；a波、b波、OPs、PhNR振幅下降，b波潜伏期延长，差异均有统计学意义（ P<0.05）；ONC3组、ONC5组、ONC7组小鼠RGC存活率呈时间依赖性降低，差异有统计学意义（ F=384.90， P<0.01 ）。病毒转染后4周，转染率达峰值。与正常对照组相比，AAV2-shHspB8组视敏度，a波和b波、OPs、PhNR振幅、RGC计数差异均无统计学意义（ P>0.05）；ONC5+AAV2-shHspB8组RGC计数较ONC5组明显升高，差异有统计学意义（ F=10.62， P<0.01 ）。 结论:ONC诱导HspB8在视网膜中表达，导致RGC死亡并损害小鼠视功能；下调HspB8对ONC所致的RGC死亡具有保护作用。

目的:利用脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，研究中介素对腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）诱导的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化和细胞焦亡的影响及其机制。方法:细胞分组为：对照组，脂多糖组，中介素处理组，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）阻滞剂LY294002组。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测细胞NLRP3炎症小体的激活情况及炎症因子IL-1β和IL-18表达，碘化丙锭（PI）染色法检测细胞焦亡的改变。计量资料以 ± s表示，组间差异比较采用方差分析，以 P<0.05为差异有统计学意义。 结果:与对照组[（0.83±0.09），（0.49±0.04）]比较，脂多糖组磷酸化（p）-PI3K/PI3K（0.44±0.05），p-Akt/Akt（0.27±0.06）比值均显著降低，与脂多糖组相比，脂多糖+中介素组细胞中p-PI3K/PI3K（1.22±0.18），pAkt/Akt（0.83±0.09）比值均显著升高（ F=31.40， P<0.001； F=50.88， P<0.001）。与对照组比较，脂多糖组（脂多糖和ATP）可刺激RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-18和NLRP3炎症小体（NLRP3，caspase-1，ASC）的mRNA及蛋白表达上调；与脂多糖组相比，中介素处理可抑制炎症因子IL-1β、IL-18和NLRP3炎症小体表达，这种效应可被PI3K/Akt通路的阻滞剂LY294002所阻断。Real-time PCR结果显示，IL-1β mRNA相对表达量：对照组为（1.00±0.11），脂多糖组为（8.32±0.61），脂多糖+中介素组为（8.32±0.55），脂多糖+中介素+LY组为（7.23±0.41）（ F=15.42， P<0.001）；IL-18 mRNA相对表达量：对照组为（1.00±0.17），脂多糖组为（1.82±0.21），脂多糖+中介素组为（1.14±0.15），脂多糖+中介素+LY组为（1.53±0.11）（ F=18.16， P<0.001）；NLRP3 mRNA相对表达量：对照组为（1.00±0.13），脂多糖组为（2.58±0.18），脂多糖+中介素组为（1.07±0.17），脂多糖+中介素+LY组为（1.33±0.32）（ F=15.98， P<0.001）；caspase-1 mRNA相对表达量：对照组为（1.00±0.09），脂多糖组为（6.20±0.19），脂多糖+中介素组为（3.43±0.06），脂多糖+中介素+LY组为（5.50±0.45）（ F=18.39， P<0.001）；ASC mRNA相对表达量：对照组为（1.00±0.21），脂多糖组为（4.58±0.48），脂多糖+中介素组为（2.07±0.51），脂多糖+中介素+LY组为（3.33±0.32）（ F=15.19， P<0.001）。蛋白质免疫印迹结果显示，IL-1β蛋白相对表达量：对照组为（100%），脂多糖组为[（188±14）%]，脂多糖+中介素组为[（112±11）%]，脂多糖+中介素+LY组为[（171±27）%]（ F=21.25， P<0.001）；IL-18蛋白相对表达量：对照组为（100%），脂多糖组为[（183±16）%]，脂多糖+中介素组为[（115±19）%]，脂多糖+中介素+LY组为[（179±23）%]（ F=19.62， P<0.001）；NLRP3蛋白相对表达量：对照组为（100%），脂多糖组为[（149±15）%]，脂多糖+中介素组为[（106±10）%]，脂多糖+中介素+LY组为[（144±15）%]（ F=14.35， P<0.001）；ASC蛋白相对表达量：对照组为（100%），脂多糖组为[（188±12）%）]，脂多糖+中介素组为[（110±18）%]，脂多糖+中介素+LY组为（192±8）%（ F=15.79， P<0.001）。 结论:中介素通过调节PI3K/Akt活性，抑制NLRP3炎症小体的活化与细胞焦亡。

目的:分析血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)抑制性突变相关炎症机制及其潜在干预药物，为治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)提供参考。方法:从肿瘤基因图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库筛选具有ACE2突变的肺腺癌数据，采用R程序语言edgeR包与clusterProfiler包对数据进行差异分析、基因本体学(gene ontology，GO)功能富集分析与京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。使用String在线分析网站对差异基因进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络分析，筛选出核心基因。应用表观精准治疗预测平台(Epigenomic Precision Medicine Prediction Platform，EpiMed)对关键基因进行多组学关联分析和药物预测。结果:共得到差异基因1 005个，其中表达上调91个，下调914个。GO富集71条，其中生物学进程45条，细胞组分16条，分子功能10条。KEGG通路共富集13条，主要富集在炎症通路、病毒感染性疾病、转录调控、药物代谢和蛋白质消化吸收相关通路。PPI网络分析共得到252个蛋白质，H2A簇状组蛋白16、H3簇状组蛋白2、H3簇状组蛋白7、H3簇状组蛋白11、H3簇状组蛋白3、H2B簇状组蛋白3、H2B簇状组蛋白6、H4簇状组蛋白2、H1-4接头组蛋白、H2A簇状组蛋白4为筛选出的10个核心基因。α干扰素、白藜芦醇、塞来昔布、鱼腥草、连翘、地塞米松、白头翁、肿瘤坏死因子α抑制剂、甘草和泛昔洛韦可能是治疗ACE2突变相关炎症的药物。结论:ACE2抑制性突变相关炎症与COVID-19发病机制类似，通过激活促进丝裂原活化蛋白激酶、Janus激酶/信号转导及转录激活因子和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白等炎症通路导致疾病发生，白藜芦醇、干扰素、塞来昔布等药物可能对COVID-19具有潜在治疗作用。

目的 制备用于肿瘤光热治疗的载吲哚菁绿(ICG)血小板膜仿生纳米粒(ICG-PLP),并对其体外特性进行初步评价.方法 采用超声法制备ICG-PLP,并用激光粒度仪测定其粒径及zeta电位,用紫外分光光度法检测其包封率,在808 nm近红外光(2 W/cm2)照射下考察其光热性质,用SDS-PAGE观察血小板膜蛋白保留情况,用激光共聚焦显微镜考察制剂被小鼠巨噬细胞RAW264.7及人非小细胞肺癌细胞A549、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10、小鼠乳腺癌细胞4T1摄取的情况,用MTT法检测ICG-PLP光毒性,通过考察溶血率及细胞相容性初步评价其安全性.在健康SD大鼠体内尾静脉注射给药后考察ICG、载ICG脂质体和ICG-PLP的体内循环时间.结果 成功制备了ICG-PLP,其平均包封率为(97.68±0.01)％,平均粒径为(109.77±0.76)nm,平均zeta电位为(-21.23±0.84)mV,多分散系数为0.22±0.01.ICG-PLP很好地保留了血小板膜上的蛋白质,并具有良好的光热性能.血小板膜能促进仿生纳米粒被A549、B16-F10、4T1等肿瘤细胞摄取,并减少巨噬细胞对仿生纳米粒的吞噬.ICG-PLP展示出良好的光热治疗效果,能杀伤肿瘤细胞,且有良好的安全性.静脉给药后,ICG-PLP能延长ICG在健康SD大鼠体内的滞留时间.结论 成功构建了ICG-PLP,其在药物靶向递送和肿瘤光热治疗方面具有很大的潜力.

目的 探讨奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)对人结肠癌(SW620)细胞转录表达谱的影响.方法 采用CCK-8试验观察终浓度为0(对照)、4、8、16、32、64、100、128 mg/LOXA暴露24 h对SW620细胞的增殖抑制作用,计算半抑制浓度(IC50)值(64 mg/L)作为转录组测序的剂量浓度.采用RNA-seq方法进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行GO富集分析、KEEG富集分析、PPI网络构建,探讨OXA的肿瘤增殖抑制作用可能涉及的差异基因、信号通路和生物学过程.结果 与对照组比较,16、32、64、100、128 mg/LOXA暴露组SW620细胞的存活率均下降,差异有统计学意义(P＜0.05);且随着OXA暴露浓度的升高,SW620细胞存活率呈现下降趋势.与对照组比较,OXA组差异表达基因8 187个,其中上调基因2114个,下调基因6073个.GO富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在Wnt信号通路、蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶活力、蛋白激酶活力、蛋白质磷酸化等过程.KEEG富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在黏着连接、胞吞作用、癌症中的蛋白聚糖、癌症途径、Wnt信号通路等途径.通过PPI网络构建,MCODE和CytoHubba算法筛选出10个hub基因,分别为 UQCRQ、NDUFA1、ATP5IF1、UQCR11、COX6A1、COX7A2、COX7B、NDUFA6、NDUFA4、COX8A.结论 OXA 对入结肠癌细胞SW620的增殖抑制作用可能与其调节细胞线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关.

目的 采用"分子对接-分子动力学-体外药理学"研究方法筛选并优化阻断程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡配体 1(programmed cell death protein 1/programmed death-ligand 1,PD-1/PD-L1)结合,获得具有较高抗肿瘤活性的多肽小分子化合物.方法 利用本团队构建的5肽化合物数据库,以及从蛋白质数据库(protein databank,PDB)中下载的PD-L1蛋白质三维结构数据,采用Molecular Operating Environment软件进行柔性分子对接得到多肽化合物;对其中 GWVI/WSA(generalized Born volume integral/weighted surface area)自由能变化值(ΔG)排名最高的化合物分子进行分子动力学计算分析,包括配体重原子位置变动的均方根偏差(root mean square error,RMSD)以及相互作用能[为兰纳-琼斯势能(Lennard-Jones potential)与库伦势能(Coulombic energy)之和].通过均相时间分辨荧光(homogeneous time-re-solved fluorescence,HTRF)技术分析配体化合物对PD-1/PD-L1相互结合的阻断作用,建立Jurkat T淋巴细胞与黑色素瘤B16-F10细胞的共培养体系,探索化合物配体对T细胞杀伤肿瘤作用的影响以及对共培养上清液中IL-2分泌水平的影响.结果 在筛选的多肽化合物中,RGGHA与RGGHH与PD-L1的结合更为稳定,其中RGGHA与PD-L1存在多种相互作用力,与PD-1竞争性结合PD-L1的Asp122、Try123、Lys124等位点阻断PD-1/PD-L1信号转导.HTRF实验表明,RGGHA对PD-1和PD-L1结合抑制率为58.38％,RGGHH为42.73％.此外,在共培养体系中,RGGHA与RGGHH能够显著增加IL-2的分泌水平,提高T细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力,激活肿瘤免疫微环境.结论 研究发现多肽化合物RGGHA与RGGHH可以有效阻断PD-1/PD-L1相互作用,重新激活有利于抗癌的免疫反应,可以将其作为先导化合物用于新药研发.

目的:制备鼠源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor,mGM-CSF)与促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)的融合蛋白mGM-CSF-GnRH3 (mGGn)和mGM-CSF与胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)的融合蛋白mGM-CSF-GRP6(mG6),探讨这两种融合蛋白在体外对黑色素瘤B16F10细胞的抑制效果,并对其等电点、相对分子质量、疏水性、稳定性、亚细胞定位、信号肽、空间结构、潜在抗原表位等进行初步预测.方法:mGGn与mG6融合蛋白制备成功后,通过显微观察、划痕实验、CCK-8法、流式细胞术分别检测不同浓度蛋白对B16F10细胞形态、细胞迁移、细胞增殖、细胞周期的影响,利用蛋白质在线分析系统EXPASY、GOR4、SWISS MODEL对重组融合蛋白进行基本属性、二三级结构分析预测,运用IEDB和ABCpred软件综合预测其B细胞抗原表位,采用SYFPEITHI、B1MAS和NetCTL软件综合预测其CTL表位,利用NetMHCIIpan 3.1 Server和IEDB软件综合预测其Th表位.结果:mGGn和mG6融合蛋白均抑制肿瘤细胞的增殖和迁移;mGGn能使B16F10细胞周期阻滞于G1期,mG6能使B16F10细胞周期阻滞于S期,不能进入G2期,从而抑制瘤细胞的增殖.mGGn和mG6结构丰富,含有较多潜在的B细胞、CTL和Th表位.结论:mGGn与mG6融合蛋白在体外对黑色素瘤B16F10细胞具有抑制作用,其生物信息学预测为进一步研究两种融合蛋白的生物学功能和免疫活性奠定了基础.

1 材料与方法120只成年雄性SD大鼠来源于陆军军医大学实验动物中心,将大鼠分为正常组、烧伤组、烧伤+肠三叶因子(ITF)组,每组40只.所有大鼠均给予剔除躯干毛发,苯巴比妥钠麻醉,2个烧伤组大鼠造成30％ TBSAⅢ度烧伤.钙离子螯合法提取肠上皮细胞(IECs),镁离子梯度离心法制备IECs刷状缘囊泡(BBMVs).采用透射电镜观察BBMVs结构变化,核素液相闪烁仪检测IECs及BBMVs对谷氨酰胺的转运能力.采用蛋白质印迹法检测IECs中ASCT2和B0AT1及其相关调控蛋白磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、p-62、LC3-Ⅱ、二硫键异构酶(PDI)蛋白水平的变化.采用荧光定量PCR技术观察IECs中ASCT2、B0AT1、CHOP、GRP78、PDI mRNA水平的变化.采用PDI亚硝基化实验和胰岛素聚集实验检测PDI的活性变化.体外实验培养IEC-.6细胞株,分为正常血清组、烧伤血清组、烧伤给药组、烧伤给药后抑制AMPK组、烧伤给药后抑制自噬组、烧伤给药后抑制PDI组,正常血清组细胞加入体积分数10％正常大鼠血清培养,5个烧伤组细胞均加入体积分数10％烧伤大鼠血清培养,后4组细胞还分别加入ITF(10 μg/mL,质量浓度下同)培养、ITF+复合物C培养、ITF+ 3-MA培养、ITF+16F16培养.检测前述蛋白表达.采用双向方差分析统计数据,P ＜0.05为差异有统计学意义.

目的 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知最重要的血管生成调节因子,VEGF与其受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)特异性结合,调节血管及肿瘤血管的生成.本研究靶向vegf及其受体vegfr2基因小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对小鼠黑色素瘤细胞B16F10移植瘤生长的影响.方法 将B16F10细胞皮下注射于C57BL6小鼠腋下,构建小鼠黑色素瘤模型.于B16F10细胞注射后7 d,将目标siR-NA与转染试剂EntransterTM-in vivo制成转染复合物,通过瘤内注射靶向vegf/vegfr2基因的siRNA.测量不同处理后移植瘤的体积、质量,并对肿瘤组织进行HE染色,蛋白质印迹检测肿瘤组织中VEGF/VEGFR2蛋白的表达.结果 转染vegf及vegfr2 siRNA组的肿瘤体积、质量小于对照组.第12天时PBS组肿瘤体积为3322 mm3,转染vegf及vegfr2 siRNA组肿瘤体积分别为1467、1418 mm3,差异有统计学意义,F值分别为10.760和3.986,P值分别为0.002和0.025;第12天剥离肿瘤,空白对照(PBS)组肿瘤质量1.917 g,转染vegf及vegfr2 siRNA组肿瘤质量不及对照组的1/2,分别为1.013、0.723 g,差异均有统计学意义,F值分别为63.912和43.791,P值分别为0.013和0.003.HE染色分析显示,vegf及vegfr2 siR-NA干扰组肿瘤细胞稀疏,血管壁完整性不一.转染vegf或vegfr2 siRNA组肿瘤组织中VEGF及VEGFR2蛋白表达降低,分别是PBS组的0.605、0.310倍,F值分别为10.381和157.403,均P<0.001.结论 靶向vegf或vegfr2的siRNA能够抑制小鼠B16F10移植瘤的生长及肿瘤血管的形成,有效抑制肿瘤组织中VEGF/VEGFR2蛋白的表达.所筛选的靶向vegf/vegfr2的siRNA可作为一种基因沉黙的方法应用于血管生成相关研究中.

目的 探讨降钙素原(PCT)、C反应蛋白(PCR)检测在慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)中的应用及对抗菌药物使用的指导价值.方法 选取2014年6月至2018年6月余姚市第三人民医院收治的AECOPD患者82例为研究对象,根据患者入院时PCT水平分为A、B、C三组.血清PCT水平＜0.10μg/L为A组(n=17),给予化痰平喘和对症治疗,不进行抗菌药物治疗;血清PCT水平0.10～0.25 μg/L为B组(n=33),不进行抗菌药物治疗,如隔日PCT水平≥0.25 μg/L或升高幅度＞30％时,治疗方法同C组;血清PCT水平＞0.25 μg/L时为C组(n=32),给予化痰平喘、对症治疗,同时给予抗菌药物.比较三组患者的临床资料、实验室检测指标及临床疗效.结果 三组患者一般临床资料差异均无统计学意义(均P＞0.05).三组患者发热分别为2例(11.76％)、16例(50.00％)、19例(57.58％),呼吸困难分别为6例(35.29％)、25例(78.13％)、31例(93.94％),哮鸣音分别为4例(23.53％)、26例(81.25％)、33例(100.00％),湿哕音分别为12例(70.59％)、27例(84.37％)、33例(100.00％),三组间上述指标差异均有统计学意义(x2=15.827、24.361、30.284、18.644,均P＜0.05).三组患者血培养阳性患者分别为4例(23.53％)、10例(31.25％)、23例(69.69％),痰培养阳性患者分别为5例(29.41％)、24例(75.00％)、28例(84.85％),三组上述指标差异均有统计学意义(x2=16.871、24.644,均P＜0.05).三组患者白细胞(WBC)计数分别为(4.27±1.92)×109/L、(8.64±3.77)×109/L、(18.06±4.87)×109/L;中性白细胞百分比分别为(54.12±3.48)、(82.19±5.67)、(90.07±9.33);PCT水平分别为(0.09±0.08) μg/L、(0.21±0.12) μg/L、(0.74±0.33) μg/L,三组间WBC计数、中性白细胞百分比、PCT水平比较,差异均有统计学意义(F=14.827、25.825、19.873,均P＜0.05).三组间CRP水平差异无统计学意义(P＞0.05).A组患者未使用抗菌药物治疗且临床症状好转;B组14例未使用抗菌药物且临床症状好转,18例患者加用抗菌药物治疗;C组使用抗菌药物治疗后,20例症状明显好转,12例更换抗菌药物治疗方案,1例死亡.结论 PCT、CRP可以作为AECOPD病情严重程度的评价指标,且可作为抗菌药物使用或更换与否的参考工具.