目的 通过重叠PCR方法获得AEG-1C-Flic融合基因,采用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统获得重组AEG-1C-Flic杆状病毒,为后续AEG-1C-Flic病毒样颗粒疫苗的制备奠定基础.方法从鼠伤寒沙门菌的基因组中PCR扩增细菌鞭毛蛋白Flagellin,采用重叠PCR的方法将AEG1肺归巢域段基因与Flagellin融合,并添加猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)包膜蛋白gp41信号肽与跨膜区,构建AEG-1C-Flic pFastBacTM重组表达载体,转座大肠杆菌E.coliDH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒,重组杆粒转染昆虫细胞Tn5,获得AEG-1C-Flic重组杆状病毒,并采用Western Blot方法对该病毒进行鉴定.结果构建的AEG-1C-Flic杆状病毒表达载体经双酶切及测序正确,通过转化E.coli DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,经PCR鉴定大小正确,Western Blot结果显示Bacmid转染Tn5细胞后成功获得重组杆状病毒rBv AEG-1C-Flic.结论成功构建的AEG-1C-Flic杆状病毒可用于新型AEG1-病毒样颗粒疫苗的制备.

目的 探讨铜绿假单胞菌中Ⅵ型分泌系统(T6SS)和群体感应(QS)系统在铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用.方法 将铜绿假单胞菌生物被膜阳性的模式菌株PAO1制备成生物被膜菌和浮游菌.采用实时荧光定量PCR法检测菌株中T6SS相关溶血素共调节蛋白(Hcp)基因Hcp1、Hcp2和Hcp3,QS系统相关基因LasR,胞外多糖相关多糖合成位点基因A(PslA)和菌膜基因A(PelA),以及Ⅳ型菌毛基因(PilA)和鞭毛蛋白基因(FliC)的表达水平.采用独立样本t检验比较PAO1生物被膜菌与浮游菌中上述基因表达的差异.结果 PAO1生物被膜菌PslA、PelA、PilA和FliC基因的相对表达量均明显高于浮游菌,分别为浮游菌的714、274、604和42倍(P均<0.05),提示制备的PAO1生物被膜菌形成了具有鞭毛和菌毛结构的成熟生物被膜.PAO1生物被膜菌Hcp1、Hcp2、Hcp3和LasR基因的相对表达量均明显高于浮游菌,分别为浮游菌的1045、11268、6654和1226倍(P均<0.05),提示T6SS和QS系统与PAO1菌生物被膜的形成有关.结论 铜绿假单胞菌中T6SS和QS系统可能参与生物被膜形成,其具体调控机制有待进一步研究.

[目的]为比较反式和顺式肉桂醛对肉源假单胞菌生物被膜和致腐性的影响.[方法]通过平板计数测定两种肉桂醛对隆德假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC),结晶紫法、珠涡流法、激光共聚焦显微镜观察、福林法等检测亚抑菌浓度肉桂醛处理下隆德假单胞菌生物被膜形成、运动性和胞外酶活性变化.荧光定量RT-PCR检测肉桂醛对隆德假单胞菌粘附lapA、鞭毛iC、蛋白酶aprX和脂肪酶lip基因表达量的影响.[结果]反式和顺式肉桂醛对隆德假单胞菌的MIC分别为200 μg/mL和225μg/mL,1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC亚抑菌浓度肉桂醛显著降低隆德假单胞菌生物被膜结晶紫和粘附性,其中1/2 MIC反式和顺式肉桂醛处理下被膜分别减少60.27％和52.05％,菌体粘附降低56.35％和61.10％.亚抑菌浓度肉桂醛显著减少被膜厚度,反式肉桂醛还能显著杀灭被膜菌.且肉桂醛能显著抑制菌体的泳动性,反式肉桂醛对生物被膜和泳动性的抑制效果更强.肉桂醛还能抑制隆德假单胞菌蛋白酶和脂肪酶活性,其中1/2 MIC反式和顺式肉桂醛处理下菌体蛋白酶分别减少61.90％和76.19％,脂肪酶降低40.17％和47.01％.且发现肉桂醛显著降低lapA、fliC、aprX和lip表达量,其中1/2 MIC反式和顺式肉桂醛分别降低4个基因表达量至对照组的0.05-0.16和0.02-0.12倍.[结论]两种亚抑菌浓度肉桂醛异构体显著抑制隆德假单胞菌生物被膜和致腐性,其中反式肉桂醛对生物被膜抑制较强,而顺式肉桂醛更有效地降低致腐酶活性,其与肉桂醛下调相应基因表达密切相关.

构建基于TeI3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统(Thermotargetron),并应用于中温微生物基因编辑.在大肠杆菌HMS174 (DE3)基因组中,选择Subunit of flagellum基因(fliC)和C4 dicarboxylate orotate:H-+symporter基因(dctA)为靶基因.根据TeI3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、iC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点.使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TTlA质粒构建打靶载体.打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48℃热激1h后涂布于氯霉素抗性LB平板上.使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率.获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定AfliC、△dctA突变株表型变化.菌落PCR测序结果表明,TeI3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100％.突变株表型验证实验表明,△fliC突变株运动能力显著下降,AdctA突变株苹果酸代谢能力缺失.综上所述,文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统,该系统可通过控制宿主菌在48℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活.

目的 探讨尿路感染大肠埃希菌生物膜的表型与基因型鉴定和耐药性的关联.方法 2019年1月至2020年1月尿路感染患者分为2组:大肠埃希菌组(UPEC患者,n=210)和非大肠埃希菌组(年龄和性别匹配的其它尿路感染患者,n=64).对尿液样品进行处理,并按照标准规程通过标准的微生物学程序鉴定细菌分离物.将分离物在BHI肉汤中于37℃下培养24h,通过分光光度法检测两组分离物生物膜形成.使用琼脂扩散技术进行了抗生素敏感性试验.通过PCR检测毒力因子(papC,fimH,kpsMTII和fliC)的存在与否.通过多重PCR检测blaTEM,blaCTX-M,blaSHV和blaOXA基因.通过对大肠埃希菌菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析来评估菌株的遗传多样性.结果 本研究共涉及210例UPEC患者,平均年龄42.16±5.37,男性患者71例(33.81％),女性患者139例(66.19％).这些病例更常见于妇产科107(50.95％),其次是泌尿外科71(33.81％)和肾内科32(15.24％).非大肠埃希菌组与大肠埃希菌组性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒和科室均没有差异性统计(P＞0.05).女性的UPEC发病率较高,女性占66.19％,男性占33.81％,21至40岁年龄段的女性更常见,共67人,其次是41至60岁年龄段的女性,共37人(17.62％).生物膜形成试验阳性率为40.51％(111),大肠埃希菌的试验阳性率为48.57％(102),其他的大肠菌群生物膜试验阳性率为14.06％(9).210株UPEC菌株对6种抗菌药物表现出不同程度耐药性,其中对氨苄西林耐药率最高(50.48％),对庆大霉素耐药率最低(8.57％).生物膜阳性组对氨苄西林(71.57％)、庆大霉素(13.73％)和环丙沙星(40.20％)的耐药率高于生物膜阴性组(30.56％,3.70％和10.19％)(P＜0.05).生物膜阳性组β-内酰胺酶(ESBL)、fimH、fliC、papC、kpsMTII、blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和blaOXA阳性率均较物膜阴性组高(P＜0.05).blaTEM阳性组对氨苄西林(80.87％)、头孢噻吩(40.87％)、庆大霉素(13.04％)、左氧氟沙星(40.87％)、环丙沙星(37.39％)和头孢他啶(21.74％)的耐药率高于blaTEM阴性组(13.68％,7.37％,3.16％,13.68％,20.00％和3.16％)(P＜0.05).结论 UPEC生物膜形成对抗生素(氨苄西林、庆大霉素和环丙沙星)的耐药率高于生物膜阴性,生物膜阳性基因型阳性率较高.blaTEM阳性对抗生素的耐药率高于blaTEM阴性.

构建编码大肠杆菌鞭毛蛋白基因(fliC)失活突变株,并探究其生物被膜形成改变后在应激状态下的生物学特征.使用Thermotargetron靶向基因失活系统,构建fliC基因失活突变株(ΔfliC420s),测定ΔfliC420s与野生型菌株的生长速率、运动能力、生物被膜形成能力、自溶速率、pH敏感性及对抗生素耐受性的变化.ΔfliC420s相比野生型菌株,生长速率未受影响,在半固体培养基中运动能力缺失,生物被膜形成能力明显降低,菌体自溶速率加快,pH敏感性增强,以及对D-环丝氨酸、红霉素、诺氟沙星的耐受性降低.大肠杆菌fliC基因在细菌生物被膜形成和对外界压力的抵抗中具有重要作用.

目的 调查脊髓损伤患者致病性大肠埃希菌分子分型、流行病学和毒力特征.方法 选取2017年1月-2019年12月入院治疗的脊髓损伤合并泌尿系感染患者86例,共分离、鉴定出致病性大肠埃希菌56株,进行多位点序列分型和药敏试验,采用多重聚合酶链反应(PCR)方法检测毒力因子基因和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)情况.结果 86例脊髓损伤合并泌尿系感染患者共检出病原菌105株,前3位分别为大肠埃希菌53.33％、肺炎克雷伯菌16.19％、铜绿假单胞菌8.57％.大肠埃希菌对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亚胺培南及美罗培南耐药性较低,均<15％,但对头孢他啶、头孢呋辛、头孢唑林、哌拉西林、环丙沙星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药性较高,均>50％.56株致病性大肠埃希菌共鉴定出24个ST分子分型,其中前5位ST型分别为ST131、ST1193、ST405、ST38、ST648;毒力因子基因dsdA、tonB、fimH、degP、ompR检出率较高,均>80％,而ireA、neuC、fliC在致病性大肠埃希菌中检出率较低,均<25％;大肠埃希菌中产ESBLs菌株检出44株,检出率为78.57％,其中仅携带有1种基因型有40株(90.91％),以blaCTX-M-14检出率最高(54.55％).结论 脊髓损伤患者致病性大肠埃希菌以ST131分子分型流行,具有较强的耐药性,且携带有多种毒力因子基因,临床应加强医院感染监测与隔离防护措施,阻碍耐药性大肠埃希菌的传播.

[背景]假交替单胞菌属是一种广泛分布于海洋环境的革兰氏阴性细菌,存在于海底沉积物中,能分泌大量的胞外产物形成海洋微生物被膜,从而诱导海洋无脊椎动物的附着.[目的]探究海假交替单胞菌鞭毛蛋白fliC基因对生物被膜形成及厚壳贻贝诱导活性的影响.[方法]通过基因敲除构建海假交替单胞菌fliC-02330基因缺失突变菌,研究突变菌和野生菌菌落形态、生物被膜形成能力、胞外物质以及对厚壳贻贝幼虫附着变态的诱导能力等的差异性.[结果]与野生菌相比,突变菌菌落表型出现褶皱,运动能力下降,形成被膜膜厚增加,以及对幼虫附着变态诱导活性下降.共聚焦扫描发现,fliC-02330基因缺失突变菌胞外多糖含量下降,而蛋白含量上升.[结论]海假交替单胞菌鞭毛蛋白fliC-02330基因缺失促进生物被膜形成,但抑制厚壳贻贝幼虫附着变态.本研究为探究细菌鞭毛蛋白基因与厚壳贻贝幼虫的作用机制,以及后续进一步探索微生物参与海洋无脊椎动物附着变态提供一定的理论依据.

[目的]研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制.[方法]用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli 10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E.coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E.coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响.[结果]Honokiol能抑制E.coli 10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E.coli 10389 BF形成的作用机制不同.其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E.coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ariR)mRNA的表达量显著提高,抗毒素(ybaJ)的mRNA表达量显著降低.亚-MIC的honokiol则能抑制E.coli 10389分泌AI-2的量,降低由其调控的与BF形成相关的下游基因的mRNA表达量.与对照组相比,16 μg/mL的honokiol可使荚膜异多糖酸基因mqsR、类黏蛋白基因mcbR和鞭毛形成基因csrA、flhD、flhC和flic的mRNA表达量分别降低65.21％、55.01％、73.16％、62.01％、60.30％和 59.71％.[结论]Honokiol 能抑制 E.coli 10389 BF 的形成,但不同浓度的honokiol其抑制E.coli10389 BF形成的作用机制不同.其中,MIC的honokiol主要是通过影响BF形成的相关基因表达量来抑制E.coli BF的形成;而亚-MIC的honokiol则主要是通过抑制Luxs/AI-2系统的AI-2合成酶luxs基因的表达量,降低AI-2的分泌量,进而影响荚膜多糖、类黏蛋白和鞭毛等合成抑制E.coli BF的形成.

[目的]探究植物乳杆菌培养上清(Lactobacillus plantarum culture supernatant,LPC)对3种血清型沙门氏菌猪霍乱(Salmonella cholerae,SC)、肠炎(Salmonella enteritidis,SE)和鸡白痢(Salmonella pullorum,SP)的生长和致病性的抑制作用效果及机理.[方法]将2％LPC与3种沙门氏菌分别共培养后,采用比浊法及牛津杯抑菌圈试验检测沙门氏菌生长情况及LPC中的主要抑菌物质,使用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)探究沙门氏菌致病性相关基因表达水平,最后通过结晶紫染色法检测沙门氏菌的生物被膜.[结果]2％LPC能够显著抑制3种沙门氏菌的生长,其作用效果与庆大霉素(gentamicin,GM)相近且对SE的生长抑制效果优于GM,其主要抑菌物质为有机酸;2％LPC对3株沙门氏菌SPI-1编码的主要毒力基因(InvA、InvF、SopE、SopB、SipB、HilA和SipA)、SPI-2毒力基因(SopD2)、菌毛相关基因(FliF、LpfA、SefA和FimF)和鞭毛相关基因(FlhD、FliC和FliD)表达均有显著抑制效果且抑制效果与GM相近;2％LPC对3株沙门氏菌的生物被膜形成均有显著抑制效果,抑菌率12 h为40％-50％、24 h为60％-80％,且作用效果与GM相似;对比发现,2％LPC对SE的生长及致病性的抑制效果优于SC与SP.[结论]2％LPC对3种血清型沙门氏菌的生长性能及致病性均有显著抑制效果,且对肠炎沙门氏菌抑制效果最佳.