[目的]旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重RPA-LFD检测方法.[方法]选取CaPV P32 基因及ORFV 011 基因的保守片段,进行目的片段扩增并构建重组质粒;设计CaPV及ORFV RPA引物各 3 对,CaPV-HP、ORFV-HP探针各 1 条;进行单重基础RPA引物筛选试验;对双重RPA-LFD的反应时间及反应温度进行优化;探索双重RPA-LFD最佳引物配比体系及最佳探针配比体系;进行双重RPA-LFD灵敏度、特异性及重复性试验;用所建立的方法对采集的 55 份临床样品进行检测.[结果]引物筛选试验结果显示,引物对CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1 的特异性最强、扩增效率最高;该方法在反应温度为 39℃、反应时间为 11 min的反应条件下扩增效率最佳;CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的最佳引物配比为 0.8 μL∶1.6 μL,CaPV-HP、ORFV-HP的最佳探针配比为 0.1 μL∶0.9 μL;双重RPA-LFD灵敏性试验最低检出限为CaPV/ORFV 4.65/3.94×100 copies/μL;特异性试验结果显示与PPRV、IBRV、Sau、SPN均无交叉反应;临床样品检测结果显示RPA-LFD检测阳性率与PCR检测阳性率相符合.[结论]成功建立了CaPV与ORFV双重RPA-LFD快速检测方法,可用于临床中CaPV与ORFV混合感染的快速鉴别诊断.

羊痘,又称传染性脓疱性皮炎或传染性深脓疱疮,由亲上皮的DNA副痘病毒(羊痘病毒)感染所致.此病毒主要在羊群流行,表现为嘴唇及口周脓疱、结痂[1].近年来人感染羊痘病毒的报道较少,本文就中南大学湘雅二医院收治的1例罕见人感染羊痘诊治过程报道如下.

本研究参照GenBank上已公布的大熊猫犬瘟热病毒(CDV)H编码的基因序列,对其抗原保守结构和识别区域进行修饰,将CDV保护性抗原H基因克隆到pMDTK-pEL载体中,然后运用酶切、连接将表达盒PELH构建到pTK-Eg载体中,从而获得重组转移载体质粒pTK-H-Eg.将重组转移载体质粒pTK-H-Eg与GTPV AV41株共转染BHK细胞,使其在细胞内发生同源重组,获得重组CDV的H基因的山羊痘病毒,然后在Vero细胞上加压筛选,利用gpt培养基筛选到稳定表达EGFP的重组病毒.通过PCR、免疫荧光以及Western Blot鉴定,证明CDV H基因成功构建到GTPV基因组中,并且在细胞中获得了正确表达.本研究获得了表达CDV H基因重组山羊痘病毒,并命名为vpTK-H-Eg.

目的 在mRNA水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法.方法 根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2 (IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧光定量PCR反应的标准曲线、溶解曲线建立.结果 山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R2均大于0.985,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解蜂;利用N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)与山羊痘AV41株感染山羊外周血淋巴细胞进行IL-4和IFN-γ mRNA表达水平检测,△N1L株与山羊痘AV41株均能能够刺激机体IL-4和IFN-γ细胞因子,但二者差异无统计学意义(t=3.333,P＞0.5).结论 本研究建立山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测,为山羊痘基因工程疫苗的研究奠定基础.

羊的皮肤上发生化脓性炎症可能为病毒感染,特别表现在羊的口腔粘膜发生糜烂化脓性炎性损害.买羊头的人进行剥离时,可以将羊感染病灶传染给人,使剥羊头人的手指发生类似羊痘样损害,我科在近一年来门诊中接诊几十例,现将经系统观察和治疗的15例并1例典型病例报告如下.

报道2例人感染羊痘,通过临床及实验室经荧光PCR检测确诊.例1,女,55岁.有病羊接触史,左手无名指出现黄豆大感染性肉芽肿改变1个月,外阴多发疣状增生20天.例2,女,46岁.左手两个手指有红色结节伴触痛半月,发病前有病羊接触史.两例患者经PCR检测羊痘病毒DNA均阳性,经抗病毒及冷冻治疗后皮肤逐渐恢复正常.

报道3例羊痘.与以往报道的病例多发于畜牧人员不同,本文3例患者为同一餐饮店从业人员.3例患者均表现为结节、脓疱伴痒痛,均有病羊接触史,组织病理特点均符合羊痘诊断.经抗病毒及对症治疗后好转.

目的:为筛选出表达LacZ基因重组山羊痘病毒的适宜培养细胞系.方法:将常用于培养山羊痘病毒(GPV)的乳仓鼠肾细胞(BHK21)、羊肾细胞(SK)和羔羊睾丸细胞(LT)培养至单层,之后单层细胞用含X-gal的培养基继续培养,观察比较各细胞在X-gal环境中呈现的蓝色.提取单层细胞的RNA,进行LacZ基因的RT-PCR,回收PCR产物、连接载体、转化E.coli挑阳性克隆测序分析.将单层细胞继续培养72 h,检测各细胞产生的β-半乳糖苷酶.结果:随着培养时间的延长,固体培养的BHK21、LT细胞孔中胶颜色变蓝且逐渐加深,显微镜观察可见细胞蓝斑,而SK细胞、空白、无X-gal孔中的胶未变色,镜检无细胞蓝斑;液体培养的单层细胞逐渐脱壁,培养液未见蓝色.RT-PCR产物电泳条带与预期分子量大小相符,测序结果显示目标DNA与LacZ基因序列相似性值达100％,表明3种细胞均有LacZ基因的转录本.β-半乳糖苷酶测定结果显示3种细胞均表达此酶,细胞产酶能力比较为BHK21＞LT＞SK,尤以SK细胞产β-半乳糖苷酶量极低.结论:显色差异法筛选出的羊肾细胞适宜培养表达LacZ基因的重组山羊痘病毒,结果可为山羊痘病毒新型疫苗研发提供一些参考.

本研究旨在体外组装小尾寒羊OLA Ⅰ蛋白与绵羊痘病毒多肽复合物,筛选绵羊痘病毒CTL表位肽.首先克隆小尾寒羊OLA Ⅰ重链基因胞外区OLA Ⅰ α-BSP和轻链基因OLA Ⅰ-β2m,将获得的轻、重链基因分别插入原核表达载体pET-28a(+)并转化至BL21(DE3)细胞进行诱导表达,收集菌体超声破碎,过镍柱纯化获得一定纯度的OLA Ⅰ重链和轻链β2m包涵体蛋白,稀释复性法将获得的轻、重链包涵体蛋白与绵羊痘病毒多肽PV4按摩尔比为1∶1∶1的比例进行共复性,分子筛层析验证复性情况,ELISPOT试验评价OLA Ⅰ分子限制性多肽引起的T细胞免疫应答.结果 表明,克隆获得的重、轻链基因正确表达,大小分别为36.3 kDa和16.7 kDa,分子筛和SDS-PAGE结果表明,绵羊痘病毒多肽PV4与OLA Ⅰ分子稳定结合,ELISPOT试验确定该多肽可刺激引起T细胞免疫应答.本研究建立了小尾寒羊OLA Ⅰ分子轻、重链的原核表达体系,实现该轻、重链与绵羊痘病毒多肽PV4的复性,确定了1个绵羊痘病毒CTL表位肽,为下一步解析该复合物的结构及对羊痘CTL表位筛选提供思路.

本研究旨在建立小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法.以H蛋白 4 个反应原性较好的B细胞表位串联后为检测抗原,在确定抗原包被量和血清稀释度,优化血清和酶标二抗反应时间的基础上,用ROC曲线分析确定检测临界值,建立了小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法,然后对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价.结果显示,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法最佳抗原包被浓度为1.5×10-6 μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶100;血清及酶标二抗孵育时间均为 10 min,检测方法的临界值为S/P=9.77％,批内及批间变异系数均小于 10％;与口蹄疫、羊痘、蓝舌病及山羊传染性胸膜肺炎阳性血清不发生交叉反应;用建立的化学发光法和市售小反刍兽疫抗体cELISA试剂盒平行检测 247 份田间血清,两者相对符合率为 94.33％,但化学发光法敏感性更高.研究结果表明,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析方法灵敏、特异、稳定,可用于田间血清样品小反刍兽疫抗体检测.