目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

[目的]鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节.通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法.[方法]基于MG的mgc2 基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对 120 份临床样品进行检测.[结果]双重LFD-RPA检测方法在 37℃下反应 5-10 min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1 最佳引物配比为 0.6∶1.4.MG、MS的最低检出限分别为 3.75 copies/μL、3.46 copies/μL.用该方法与OIE推荐的PCR方法对 120 份样品进行检测,二者符合率为 93.3%.[结论]MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测.

[目的]旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重RPA-LFD检测方法.[方法]选取CaPV P32 基因及ORFV 011 基因的保守片段,进行目的片段扩增并构建重组质粒;设计CaPV及ORFV RPA引物各 3 对,CaPV-HP、ORFV-HP探针各 1 条;进行单重基础RPA引物筛选试验;对双重RPA-LFD的反应时间及反应温度进行优化;探索双重RPA-LFD最佳引物配比体系及最佳探针配比体系;进行双重RPA-LFD灵敏度、特异性及重复性试验;用所建立的方法对采集的 55 份临床样品进行检测.[结果]引物筛选试验结果显示,引物对CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1 的特异性最强、扩增效率最高;该方法在反应温度为 39℃、反应时间为 11 min的反应条件下扩增效率最佳;CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的最佳引物配比为 0.8 μL∶1.6 μL,CaPV-HP、ORFV-HP的最佳探针配比为 0.1 μL∶0.9 μL;双重RPA-LFD灵敏性试验最低检出限为CaPV/ORFV 4.65/3.94×100 copies/μL;特异性试验结果显示与PPRV、IBRV、Sau、SPN均无交叉反应;临床样品检测结果显示RPA-LFD检测阳性率与PCR检测阳性率相符合.[结论]成功建立了CaPV与ORFV双重RPA-LFD快速检测方法,可用于临床中CaPV与ORFV混合感染的快速鉴别诊断.

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法.研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测.实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为103 cfu/mL和100 pg/nL.利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致.综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法.该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持.

目的 结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术及侧流层析试纸条法(LFD)建立日本血吸虫特异核酸片段的快速可视化检测方法,并初步评价其检测日本血吸虫感染小鼠血清中血吸虫循环核酸的应用价值. 方法 以日本血吸虫非长末端重复序列逆转录转座子SjCHGCS19为靶标,设计RPA引物和探针,以日本血吸虫基因组DNA为模板进行RPA及LFD检测,并优化RPA反应温度及时间,建立日本血吸虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法.用RPA-LFD检测模板量为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7 ng的日本血吸虫基因组DNA,评价其敏感性;用RPA-LFD方法检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫基因组DNA,评价其特异性.制备含0.01、0.1、1、10和100 ng日本血吸虫成虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清.用40条日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采集并分离感染前及感染后7、21、35 d小鼠尾静脉血清.提取模拟阳性鼠血清、感染小鼠血清样品中的循环DNA,评价RPA-LFD检测血清中血吸虫特异核酸的可行性及其早期检测价值. 结果 建立了快速可视化检测SjCHGCS19重复序列的RPA-LFD方法,30～45℃反应10 min即可检出目的片段.RPA最优反应条件为39℃,20 min.RPA-LFD对日本血吸虫成虫基因组DNA的最低检出限为10-6 ng(1fg).特异性评价结果显示,RPA-LFD检测曼氏血吸虫和埃及血吸虫基因组DNA结果为阳性,检测卫氏并殖吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果为阴性.RPA-LFD方法可成功检出含0.01～100 ng日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清以及血吸虫感染后7、21、35 d鼠血清中的游离SjCHGCS19 DNA片段. 结论 建立了一种快速、可视化检测日本血吸虫循环核酸的RPA-LFD方法,该方法敏感性高,具有检测血吸虫早期感染的潜在应用价值.

目的 基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD),建立可快速检测结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药的方法,并初步评价其临床应用价值.方法 采用比例法对182株结核分枝杆菌临床分离株进行利福平耐药性检测.建立RPA-LFD技术,检测182株菌株中利福平耐药决定区(RRDR)常见突变位点rpoB 531、526和516的突变情况,同时使用PCR测序进行验证.用SPSS 24.0分析,以比例法为金标准,评价RPA-LFD对利福平耐药的检测效率.结果 以比例法药敏结果为金标准,RPA-LFD检测利福平耐药的灵敏度为84.2％,特异度为100.0％,Kappa检验显示Kappa值为0.880,两种方法检测结果具有高度一致性.同样以比例法为金标准,以DNA测序结果判断利福平耐药性的灵敏度为91.2％,特异度为100.0％,Kappa值为0.935.结论 RPA-LFD技术用于结核分枝杆菌利福平耐药性的检测具有好的灵敏度、很高的特异度,且检测时间短,具有一定的临床应用价值.

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase ploymerase amplication,RPA)是一种新型恒温核酸扩增技术,与PCR相比,操作简便,反应快速,灵敏度高,特异性强,无需精密仪器,是一种可以替代PCR的核酸检测技术,被认为是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具.RPA与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)结合的RPA-LFD技术,可实现扩增产物的可视化检测,在病原体现场核酸快速检测中具有良好的应用前景,这为实验动物的质量监督检验提供了一种新的方法.本文对RPA-LFD这一新型核酸检测方法的技术原理、研究现状、技术瓶颈及用于现场核酸提取的研究进展进行综述.

目的 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD),建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法,并初步评价其检测效能.方法 以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列,利用Primer Primer 5软件结合手工辅助,设计特异性引物和探针并进行筛选,建立曼氏血吸虫核酸LFD-RPA检测方法.制备不同浓度(1ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl)的曼氏血吸虫成虫基因组DNA和含有不同拷贝数浓度(105、104、103、102、101、100、10-1拷贝/μl)的SmCox1重组质粒DNA,评价所建立方法的敏感度.以曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、感染曼氏血吸虫双脐螺(阳性双脐螺)和阴性双脐螺、感染日本血吸虫钉螺(阳性钉螺)和阴性钉螺、华支睾吸虫成虫、大片形吸虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA为模板,评价所建立方法的特异性.将30只雌性BALB/c小鼠随机分为40尾感染组、80尾感染组和健康对照组,每组10只,建立感染小鼠模型,提取感染后1～8周的小鼠粪样和血样DNA,评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能.结果 以SmCox1基因片段为靶标建立的曼氏血吸虫LFD-RPA检测方法以39℃、20 min为最佳反应温度和时间.敏感度检测结果显示,SmCox1-LFD-RPA方法对曼氏血吸虫成虫基因组、SmCox1重组质粒的检出限分别为10fg/μl和10拷贝/μl.特异性检测结果显示,SmCox1-LFD-RPA方法仅对曼氏血吸虫和阳性双脐螺DNA特异,与其他吸虫DNA无交叉反应.SmnCox1-LFD-RPA方法对感染小鼠1～8周血样及粪样DNA的检测结果显示,40尾组小鼠自感染后3周开始出现阳性条带,80尾组小鼠自感染后1周开始出现阳性条带,且条带颜色随感染时间延长逐渐加深.结论 建立了曼氏血吸虫LFD-RPA检测方法,其检出限低、特异性强,操作简单快捷.

目的 建立重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(RPA-LFD)检测新冠病毒(SARS-CoV-2)核酸快速诊断方法,为基层医院和边远地区防控新冠病毒疫情提供技术支持.方法 根据新冠病毒N基因核苷酸序列中保守序列,通过生物信息学软件分析、设计和筛选最佳的重组酶聚合酶扩增引物及侧流层试纸探针,优化重组酶聚合酶扩增反应条件以及检验建立方法的灵敏性和特异性.结果 利用RPA-LFD法在37℃下反应15 min可检测到每个反应最低100 fg含量的新冠病毒,并与流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒没有交叉反应,因此据此可以建立灵敏性高、特异性强和可操作性强的新冠病毒快速诊断方法.结论 通过RPA-LFD技术建立的新冠病毒快速诊断方法可获得较为理想的灵敏度、特异性,为进一步研制新冠病毒核酸快速诊断试剂盒奠定了基础.

为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV.重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率.结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现.研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑.