由细粒棘球绦虫（Eg）续绦期幼虫引起的囊型棘球蚴病（CE）是目前我国重点防控的寄生虫病之一。Eg95蛋白是一种公认的疫苗候选分子，研制载体介导的Eg95疫苗是当前CE研究热点之一。本文概述了牛痘病毒、羊口疮病毒、山羊痘病毒、狂犬病毒、鼠伤寒沙门菌、卡介苗、根癌农杆菌和两歧双歧杆菌等载体介导的Eg95疫苗的研制现状，旨在为CE的免疫预防研究提供有价值的资料。

[目的]旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重RPA-LFD检测方法.[方法]选取CaPV P32 基因及ORFV 011 基因的保守片段,进行目的片段扩增并构建重组质粒;设计CaPV及ORFV RPA引物各 3 对,CaPV-HP、ORFV-HP探针各 1 条;进行单重基础RPA引物筛选试验;对双重RPA-LFD的反应时间及反应温度进行优化;探索双重RPA-LFD最佳引物配比体系及最佳探针配比体系;进行双重RPA-LFD灵敏度、特异性及重复性试验;用所建立的方法对采集的 55 份临床样品进行检测.[结果]引物筛选试验结果显示,引物对CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1 的特异性最强、扩增效率最高;该方法在反应温度为 39℃、反应时间为 11 min的反应条件下扩增效率最佳;CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的最佳引物配比为 0.8 μL∶1.6 μL,CaPV-HP、ORFV-HP的最佳探针配比为 0.1 μL∶0.9 μL;双重RPA-LFD灵敏性试验最低检出限为CaPV/ORFV 4.65/3.94×100 copies/μL;特异性试验结果显示与PPRV、IBRV、Sau、SPN均无交叉反应;临床样品检测结果显示RPA-LFD检测阳性率与PCR检测阳性率相符合.[结论]成功建立了CaPV与ORFV双重RPA-LFD快速检测方法,可用于临床中CaPV与ORFV混合感染的快速鉴别诊断.

目的 为快速、高效、准确地检出羊口疮病毒(ORFV),并进一步明确皖北地区羊群ORFV流行毒株的遗传变异情况.方法 本研究基于ORFV F1L基因建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法,对皖北地区羊场开展ORFV检测,并从阳性病料中PCR扩增ORFV的完整VIR基因,直接测序后进行遗传演化分析.结果 所建立ORFV SYBR Green Ⅰ qPCR方法的线性关系良好,R2=0.994;扩增效率高,E％=95.62％;检测速度快,理论反应时间约15 min;灵敏度较高,检测下限为10 copies/μL,是普通PCR法的100倍;重复性良好,组内和组间变异系数分别为0.44％～1.14％和2.82％～3.16％.用该qPCR方法对采集自皖北地区的168份羊临床样本进行检测,其ORFV阳性率为37.5％(63/168).PCR扩增阳性样本中ORFV的完整VIR基因并直接测序,共获得52条全长VIR基因序列,其中21条来源于山羊,31条来源于绵羊.52条VIR基因间核苷酸序列及氨基酸序列的一致性分别为95.8％～100.0％和93.5％～100.0％,与参考毒株VIR基因核苷酸序列及氨基酸序列的一致性分别为95.1％～100.0％和91.3％～100.0％.基于ORFVVIR基因的遗传进化树分析显示,本次检测的21株山羊源ORFV毒株与8株国内外山羊源参考毒株和1株人源hChi17.2017参考毒株位于同一大分支,而本次检测的31株绵羊源ORFV毒株与7株国内外绵羊源参考毒株、1株人源hMbu15参考毒株及1株OV-V疫苗毒株位于遗传距离较远的另一大分支.结论 建立了用于检测ORFV的高效、快捷、特异、灵敏、稳定的SYBR GreenⅠqPCR方法.从临床样本中检测到的不同宿主来源ORFV的VIR基因间存在较大遗传差异.该研究结果可为ORFV的临床监测、检测、诊断及防控提供参考和指导.

目的 克隆表达羊口疮病毒(Orf virus,()RFV) 024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析.方法 根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增.将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024.将原核重组质粒转化Rosetta (DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况.纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析.将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24 h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位.结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta (DE3)细胞中正确表达,大小为59 kDa.Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性.荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达.结论 本实验为后续深入研究()RFV 024基因功能和致病机制奠定了基础.

目的 获取并分析ORFV AH-F10株VIR基因序列及预测其编码蛋白的生物信息学特点.方法 利用实验室保存的羊口疮AH-F10株,设计VIR基因引物并进行PCR扩增、克隆及序列测定,同时利用生物信息学方法对其编码的蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域以及线性细胞表位进行预测.结果 AH-F10-VIR基因长552 bp,编码183个氨基酸,与Nantou株的VIR基因同源性最高,核苷酸同源性高达99.6％,氨基酸同源性为100.0％.生物信息学分析结果显示编码的蛋白相对分子量为19.88 kDa,等电点为4.83,为亲水性蛋白;α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链分别占36.07％、3.83％、43.17％和16.94％;三级结构预测显示VIR蛋白存在较多的α-螺旋与无规则卷曲,同二级结构预测结果相符;含有17个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构区域,有15个潜在的B细胞优势表位,4个CTL细胞表位以及5个Th细胞表位.结论 成功克隆了羊口疮安徽株VIR基因并预测了VIR蛋白的生物信息学相关信息,为进一步研究VIR蛋白奠定了基础.

目的 获取羊口疮病毒(ORFV)囊膜蛋白B2L并制备鼠抗B2L蛋白多克隆抗体.方法 采用PCR扩增获得B2L基因,并将其分别克隆至原核表达载体pET-32a和真核表达载体p3×FLAG-CMV-14.两个重组表达载体均经过鉴定,重组原核表达载体使用BL21大肠杆菌表达,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白.通过Tris-尿素溶液洗去非目的蛋白,Western blot法鉴定.将定量的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗ORFV B2L多克隆抗体.将真核表达重组质粒p3×FLAG-B2L转染Vero细胞、BHK-21细胞,使用间接免疫荧光法(IFA)对抗B2L蛋白的多克隆抗体鉴定,并应用于免疫组织化学染色检测患病羊唇部组织ORFV的表达.结果 Western blot法确定了制备的B2L蛋白的特异性;IFA结果表明制备的小鼠抗B2L多克隆抗体有特异性和反应原性,免疫组织化学染色法结果表明该抗体可以检测出患病羊唇部组织的ORFV.结论 成功制备了特异性的小鼠抗B2L多克隆抗体.

目的 研究羊口疮病毒(ORFV)感染HEK293T宿主细胞后,其编码的锚蛋白ORF128蛋白对宿主核因子κB (NF-κB)信号通路的影响及其机制.方法 将来自ORFV/QH02/2010株的ORF128 DNA序列分别构建至真核表达载体pCMV-tag2B和pEGFP-N1;在病毒感染细胞期间,利用反转录PCR检测ORF128 mRNA水平、激光共聚焦显微镜检测ORF128蛋白的亚细胞定位;利用双荧光素酶报告基因检测系统分析ORF128对NF-κB信号通路的调节作用,Western blot法检测NF-κBp65的核移位以及NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白磷酸化水平.结果 ORF128蛋白在病毒感染早期表达且定位于宿主细胞核,ORF128蛋白可抑制NF-κB转录因子报告载体荧光素酶活性;ORF128的表达抑制NF-κBp65的核移位和磷酸化的IκBα (p-IκBα)的降解.结论 ORF128蛋白通过抑制p-IκBα蛋白的降解过程,阻止NF-κBp65蛋白核移位,进而抑制宿主NF-κB信号通路的活化.

羊口疮在我国呈区域流行态势,各地分离株基因型混杂不清,严重制约该病的区域性防控.本研究针对黑龙江大庆地区某小型私营羊场出现的疑似羊口疮病例,采集发病的波尔山羊痂皮病料,通过病毒的分离、电镜形态学观察、本体动物回归试验、血清学检测和分子生物学鉴定,获得一株羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),命名为OV-HLJ05株.进而,病毒分子遗传学研究发现,OV-HLJ05在其主要的囊膜蛋白编码基因F1L上,与近年来国内众多分离株相差不大;同源性达95％～98.5％.而在其毒力因子编码基因VEGF方面,OV-HLJ05与9个国内外代表毒株相比,则出现了较大分歧.OV-HLJ05株与OV-SA00(USA)、OV-GO(China)和OV-SJ1(China)等3个毒株亲缘关系密切;同源性分别是93.2％、91.9％和87.2％.而与NZ2(New Zealand)、IA82(USA)、B029(Germany)、D1701(Germ any) OV-YX (China)和OV-NA-1-11(China)距离较远.但是,VEGF分子同源建模及其功能性结构域VHD分析表明,各毒株毒力因子仅在Loop3处差别明显,Loop3多态性是否决定ORFV毒力的多样性有待于进一步比较研究.本研究结果说明ORFV不同基因型在我国南北分布的复杂性,这为羊口疮分子流行病学和羊口疮的区域防控研究提供了参考.

痘病毒是一类普遍存在的病原,各种属间表现出很大的宿主差异.在脊椎动物痘病毒亚科中,如天花病毒、传染性软疣病毒和猪痘病毒等一些痘病毒,表现出狭窄的宿主范围,而如牛痘病毒、痘苗病毒和羊口疮病毒等其他痘病毒却能够感染多种哺乳动物.尽管当前对痘病毒这一现象的分子机制了解不多,然而现已知晓,病毒感染能力的强弱取决于病毒对宿主应答的调控能力.研究发现,一些痘病毒基因编码的蛋白使得病原表现出宿主的趋向性,被称为宿主范围因子.目前已在多种痘病毒中发现多个宿主范围因子,这些因子不仅影响病毒的毒力,而且决定了感染宿主的范围.本文将对脊椎动物痘病毒亚科痘病毒编码的宿主范围因子及其作用做一综述,以加深对痘病毒的分子进化和跨种感染机制的认识和理解.

羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)感染机体后能够引起强烈的免疫应答反应.为了探究ORFV对小鼠骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)成熟及未成熟的CD4+T细胞(Naive CD4+T细胞)极化作用,并且寻找ORFV感染BMDC后与免疫相关的差异表达基因.本研究用不同感染复数(Multiplicity ofinfection,MOIs)的ORFV感染BMDC,检测ORFV的感染是否能够促进BMDC成熟,即通过测定其表面共刺激分子表达情况、细胞因子的分泌情况以及细胞的吞噬功能判断BMDC是否能够成熟.使用流式方法检测该细胞对Na(i)ve CD4+T细胞刺激能力的影响,并对1 MOI ORFV作用后的BMDC进行高通量测序.结果 表明1 MOIORFV能够促进BMDC的成熟,并且能诱导Na(i)ve CD4+T细胞向Th1细胞分化.高通量测序共检测到有8241个差异表达基因,其中上调基因4205个,下调基因4036个.这些差异表达基因主要参与抗原递呈与加工过程、T细胞受体信号通路、T细胞激活与细胞因子分泌途径以及细胞凋亡信号通路中等.荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)对部分差异表达基因进行验证,结果与RNA-seq测序结果一致.本研究为进一步阐明ORFV与免疫细胞的相互作用机制奠定基础.