FERONIA(FER)受体激酶在有性生殖中的花粉与柱头信号识别中发挥重要作用,为分析类受体激酶FERONIA(FER)在羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)授粉中的作用,以羽衣甘蓝自交不亲和系(S13-bS13-b)为研究材料,采用RT-PCR从柱头中克隆得到BoFER基因,获得的BoFER cDNA序列,全长2 682 bp编码893个氨基酸,其含有高度保守激酶结构域和Ser/Thr激酶结合位点.利用qRT-PCR技术对BoFER在授粉过程中的表达水平进行分析,结果发现BoFER在不亲和授粉过程其表达量逐渐升高,而在亲和授粉过程中其表达量逐渐降低.利用酵母双杂交分析BoFER与已知的自交不亲和相关蛋白的相互作用,结果显示BoFER与S位点受体激酶BoSRK13-b的激酶域存在相互作用.

筛选羽衣甘蓝白色叶形成相关的关键基因和位点以及心叶颜色性状的遗传规律,以羽衣甘蓝红叶亲本WR、白叶亲本WB及其构建的F2 分离群体为试验材料,从F2 群体中挑选红叶和白叶植株各20 株,分别构建 2 个DNA混合池,对子代混合池和亲本分别开展 50×和 20×覆盖深度的全基因组重测序,定位白叶性状关联区间,并根据基因注释信息预测候选基因.结果表明,重测序获得 3 987 718 个单核酸多态性(SNP)标记,获得位于第 2、3 和 9 染色体的 8 个显著关联区间,根据基因注释和功能分析,筛选到 8 个候选基因(Bol030253、Bol029431、Bol012077、Bol007709、Bol030318、Bol030235、Bol030286 和Bol005195).将 8 个基因确定为羽衣甘蓝白叶的候选基因,可能在羽衣甘蓝叶片颜色形成过程中起着重要作用.

蛋白激酶C1受体(RACK1)是一个高度保守的蛋白,它具有多种功能,对植物生长发育有重要的调控作用.本研究构建过表达BoRACK1转基因羽衣甘蓝植株,以阐明该基因在羽衣甘蓝中对盐胁迫的可能功能.转基因羽衣甘蓝对盐胁迫的耐受力比野生型高,表现在其种子发芽率显著高于野生型;活性氧产生比野生型活跃,H2O2也可能参与BoRACK1调控的种子萌发过程.实时定量PCR分析表明,在过表达BoRACK1转基因植株中,BoRbohs基因的转录水平显著增强.这些结果表明,在种子萌发过程中,过表达BoRACK1正调控植物耐盐胁迫.

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)为试材,利用RT-PCR和RACE的方法从柱头中分离类蛋白质二硫键异构酶BoPDIL1-2基因.将BoPDIL1-2编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到大肠杆菌中进行原核表达与纯化;用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备BoPDIL 1-2多克隆抗体;通过免疫印迹法检测BoPDIL1-2在不同组织及不同发育阶段柱头的表达情况.氨基酸序列比对分析结果显示,羽衣甘蓝BoPDIL1-2与油菜BnPDIL1-2、拟南芥AtPDIL1-2的一致性分别是97.3％和85.5％.SDS-PAGE结果显示,在分子量58 kD处有BoPDIL1-2蛋白特异性地诱导表达.免疫印迹结果显示BoPDIL1-2在羽衣甘蓝柱头中特异表达,而且在柱头发育早期表达量较低,在开花期柱头表达量较高.

盐胁迫是植物种子萌发与植株生长的重要限制因子.以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)名古屋为材料,研究不同盐分对其种子萌发的影响,探索水杨酸(SA)及其合成抑制剂氨基茚磷酸(AIP)处理对羽衣甘蓝种子萌发的调控效应.实验结果表明,150与200 mmol·L-1 NaCl处理后的羽衣甘蓝种子活力显著降低.盐胁迫显著降低种子的吸水速率、种子活力与幼苗质量,降低苯丙氨酸裂解酶活性与内源SA含量,提高过氧化氢(H2O2)与超氧阴离子(O2·-)含量.SA可以缓解盐胁迫对羽衣甘蓝种子活力的抑制作用,通过促进内源SA合成,从而提高种子吸水率与种子活力,促进种子对K+、Mg2+的吸收,降低Na+含量.此外,外源施加SA能够显著增强超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性,降低H2O2与O2·-的积累.相反,氨基茚磷酸(AIP)处理能够增强盐胁迫对种子萌发的抑制作用,推测这与AlP处理能够显著降低种子内源SA含量密切相关.研究表明外源SA主要通过提高保护酶活性、降低活性氧积累和维持体内离子平衡来增强羽衣甘蓝的耐盐性.

叶色是羽衣甘蓝重要的观赏性状之一.本研究采用Illumina Hi-Seq2500高通量测序技术,对基因型纯合的紫叶和白叶羽衣甘蓝叶片进行转录组测序,筛选差异基因并与GO和KEGG数据库比对进行注释分析,分析羽衣甘蓝叶色形成相关基因.结果 显示,获得高质量短读序共104 608 770条,筛选出紫叶相对白叶的差异表达基因1 993个,其中上调表达基因1 094个,下调表达基因899个.根据GO功能分类可分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类64功能组.根据KEGG代谢通路分析可以分为171类,在叶色相关的类黄酮生物合成途径中黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)上调以及类胡萝卜素生物合成途径中的类胡萝卜素β-环化酶上调与紫叶形成关系密切.本研究丰富了羽衣甘蓝的转录组信息,获得了一些差异表达基因,为进一步研究羽衣甘蓝叶色形成的遗传机制提供了有价值的信息.

为揭示羽衣甘蓝二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因调控花青素合成的功能,该研究对不同叶色羽衣甘蓝的叶片花青素含量进行测定,根据结球甘蓝DFR序列信息,利用RT-PCR技术克隆羽衣甘蓝BoDFR基因并进行实时荧光定量表达分析.结果表明:BoDFR的cDNA全长为1158 bp,编码385个氨基酸,其蛋白相对分子质量为42925.06 Da,预测亚细胞定位为细胞质;蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲为DFR蛋白的主要二级结构元件.序列比对显示DFR蛋白具有NADPH结合位点和底物结合位点,属于NADB-Rossmann超基因家族.系统进化分析表明,BoDFR与结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)DFR亲缘关系最近.花青素含量测定显示,紫叶羽衣甘蓝叶片中花青素含量最高,粉叶羽衣甘蓝含量较高,而白叶羽衣甘蓝叶片中检测不到花青素.实时荧光定量PCR分析表明,BoDFR基因表达量与花青素含量高低一致,其中紫叶羽衣甘蓝叶片中BoDFR基因的表达量最高,而白叶羽衣甘蓝心叶中仅微量表达.

E类MADS-box基因SEPALLATA (SEP)-like在被子植物生殖生长特别是花器官发育方面具有重要作用.为分析羽衣甘蓝E功能MADS-box基因SEP-like基因的序列特征及其在花发育过程中的时空表达模式,以羽衣甘蓝品系‘14 line’为试材,利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了SEP直系同源基因BroaSEPl/2/3 (GenBank登录号:KC967957、KC967958、KC967960).序列和系统进化树分析表明,这3个基因分别与野甘蓝(Brassica oleracea var.oleracea)、芜菁Brassica rapa、萝卜Raphanus sativus、甘蓝型油菜Brassica napus的SEP1、SEP2、SEP3基因具有很高的同源性.推导的氨基酸序列显示,这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、Ⅰ结构域和K结构域,每一基因都有其亚家族特异的C-末端功能域SEP Ⅰ和SEP Ⅱ基序.BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3基因的开放阅读框长度分别为801 bp、759 bp、753 bp,分别编码266、252、250个氨基酸残基.半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR研究结果表明,BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3在发育的花芽中特异性表达,但是表达水平在不同发育时期以及野生型、多瓣型和少瓣型花芽中存在明显差异.

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)为材料,提取柱头RNA,利用RT-PCR分离羽衣甘蓝柱头丝裂原活化蛋白激酶4(MAPK4)基因.结果表明:获得的BoMAPK4 cDNA含有一个1122 bp开放阅读框,编码373个氨基酸,具有丝氨酸/苏氨酸结构域,无信号肽和跨膜结构.羽衣甘蓝BoMAPK4与油菜(B.napus)BnMAPK4、芜菁(B.rapa)BrMAPK4、拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMAPK4的氨基酸序列一致性分别为99.7％、99.5％、95.4％.将BoMAPK4编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Escherichia coli)中进行原核表达.SDS-PAGE结果显示,在分子量大小约45 kDa处有BoMAPK4重组蛋白特异性表达.利用亲和层析的方法获得高纯度的重组BoMAPK4蛋白.利用获得的重组BoMAPK4蛋白免疫小鼠,制备BoMAPK4的多克隆抗体.提取羽衣甘蓝萼片、花瓣、花药、柱头、花柱和子房的总蛋白,利用免疫印迹的方法进行蛋白表达检测,结果发现BoMAPK4在花瓣、花药和子房中表达的较少,在萼片和花柱中表达的较多,在柱头中的表达量最高.这些研究为探讨BoMAPK4的生物学功能奠定了基础.

以土壤紧实度、冬前生物量、根系性状、植株氮累积量等为指标对供试12种覆盖作物(豆科:紫花苜蓿、光叶苕子、毛叶苕子、红三叶、白三叶、箭筈豌豆;非豆科:苏丹草、青萝卜、Nitro radish、甘蓝型油菜、羽衣甘蓝、菊苣)在东北三江平原地区的种植效果及应用潜力进行综合评价.结果表明:12种覆盖作物在试验播期均能正常生长,不同覆盖作物与对照相比均有利于降低土壤紧实度,其中青萝卜、Nitro radish和苏丹草土壤紧实度下降最显著,分别较对照下降了 47.1％、43.4％和33.4％;覆盖作物群体冬前鲜生物量为3.38～13.98 kg·m-2,干生物量为0.78～2.43 kg·m-2,非豆科覆盖作物的生物量显著高于豆科覆盖作物;覆盖作物的群体根系体积以萝卜、油菜、菊苣较大,尤其Nitro radish的根体积高达4018.5 cm3·m-2,苏丹草的根系横向延展范围最宽;豆科覆盖作物的灰分含量显著低于非豆科覆盖作物,能提供更多易分解的有机物质;覆盖作物总氮积累量为18.72～53.09 g·m-2,其中,羽衣甘蓝和菊苣的氮积累量最高,且生物量相对较大,有利于氮的积累和固定.在三江平原地区根据主栽作物的类型与冠层结构,选择豆科的三叶草、苕子、紫花苜蓿和非豆科的萝卜、羽衣甘蓝、苏丹草作为覆盖作物进行行间或行内混播的种植方式,可以在调控土壤结构的同时促进养分循环,有利于三江平原黑土地力的提升.