目的 了解南昌市市售水产品中副溶血性弧菌的污染状况和耐药性、毒力基因携带情况及分子分型特征.方法 2021年3-9月采集南昌市各农贸市场市售小龙虾、淡水鱼蛙及相关涂抹样本170份,分离副溶血性弧菌菌株,进行抗生素耐药检测、毒力基因检测以及采用脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field GelElectrophoresis,PFGE)进行分子分型分析.结果 在采集的样品中,仅在小龙虾和小龙虾涂抹样本中分离到副溶血性弧菌,总共分离副溶血性弧菌35株,其他淡水鱼、蛙及其涂抹样品均未分离到副溶血性弧菌.针对受试的17种常见抗生素,35株副溶血性弧菌中仅有2株显示对氨苄西林耐药、1株对链霉素耐药,而对其他抗生素均敏感;35株副溶血性弧菌都携带tlh基因,但只有1株携带耐热相关溶血毒素基因trh,未发现直接耐热溶血毒素基因tdh阳性菌株;PFGE图谱聚类显示没有PFGE图谱完全一致的菌株,且这些菌株中没有明显的优势簇,亲缘关系较为疏远.结论 南昌市售水产品中小龙虾中副溶血性弧菌污染比较严重.这些污染小龙虾的副溶血性弧菌菌株一般不携带tdh等关键毒力基因,对常见抗生素较为敏感,仅对氨苄西林和链霉素存在低水平耐药.PFGE图谱聚类显示副溶血性弧菌没有明显的优势簇,这些菌株具有丰富的遗传多样性,显示具有不同的来源.

目的 对1起食物中毒事件分离的副溶血性弧菌进行病原学检测及分子分型溯源研究.方法 按照《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》GB 4789.7-2013对事件中病例的粪便/肛拭子、可疑食物等10份样本进行副溶血性弧菌的分离和鉴定.利用荧光PCR对分离出的副溶血性弧菌特异的ToxR基因进行检测,并采用多重荧光PCR对其进行不耐热性溶血毒素(tlh)、耐热直接溶血素(tdh)毒力基因和耐热相关溶血素(trh)毒力基因进行检测;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行电泳获得指纹图谱,并经BioNumerics软件对其进行聚类分析.结果 从4例病例的粪便/肛拭子和2份可疑食物样本中共分离出6株副溶血性弧菌,含5种血清型,分别为O1∶KUT、O1∶KUT、O3∶K6、O4∶KUT、OUT∶ KⅢ、O3∶KUT.6株副溶血性弧菌均扩增出副溶血性弧菌特异的ToxR基因.所有菌株tlh基因均为阳性,分离自病例的粪便/肛拭子的4株菌株tdh毒力基因均为阳性;分离自可疑食物的2株菌株中有1株为tdh毒力基因阳性,另1株为阴性;所有分离菌株trh毒力基因均为阴性.聚类分析显示,菌株间相似系数为62.3％～100.0％.分离自可疑食物的菌株与病例的菌株带型不一致,为不同菌株,分离自病例的同一血清型的菌株同源,不同血清型为不同克隆.结论 这是1起由携带tdh毒力基因的O1、03、04等多种血清型的不同克隆副溶血性弧菌混合感染引起的食物中毒事件.

目的 分析广东省江门市2017年某公司发生的一起副溶血弧菌食物中毒分离株的血清型别、耐药表型和分子特征.方法 对该起食物中毒事件分离到的15株副溶血弧菌进行血清学分型,抗生素敏感性检测,耐热直接溶血毒素基因(tdh)、耐热相关溶血毒素基因(trh)、GS-PCR和orf8基因的PCR检测,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型分析.结果 15株副溶血弧菌分离株经生化鉴定、血清学鉴定为O3∶K6型;抗生素敏感性分析显示,所有菌株均对氨苄西林和头孢唑啉耐药,对其他抗生素敏感;毒力基因PCR检测结果显示,所有菌株均为tdh+ trh-型菌株,并且携带GS-PCR和orf8基因;14株病例分离株和1株食物分离株经限制性内切酶(NotⅠ、SfiⅠ)酶切后的PFGE指纹图谱高度相似,仅存在2条带的差异.结论 该起食物中毒的病原体为O3∶K6型副溶血弧菌,携带tdh、GS-PCR和orf8基因,具有共同的耐药表型和遗传特征,此次食物中毒事件由2种克隆群的副溶血弧菌引起.

目的 海洋细菌毒素抗肿瘤是近年来兴起的用于癌症治疗的新思路.本文旨在研究耐热直接溶血毒素(TDH)对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的抑制作用.方法 利用DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75层析的方法,从海洋细菌-副溶血弧菌ATCC33846的代谢物中分离纯化得到纯度较高的耐热直接溶血毒素(TDH).通过MTT法、细胞划痕试验、凋亡试验、caspase-3活性试验比较TDH作用于不同细胞的半抑制剂浓度IC50,研究了TDH对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的作用.结果 人结肠上皮细胞NCM460、人肝成纤维细胞LO2、人肺腺癌细胞SPC A-1在TDH处理24 h之后,细胞的半抑制剂浓度IC50分别为151 μg/mL、118 μg/mL和6.7 μg/mL,正常细胞的IC50高出肺腺癌细胞近20倍.在低于5μg/mL浓度下,TDH能剂量依赖性抑制SPC-A-1细胞的生长、增殖和迁移能力.流式细胞法和荧光试剂检测表明:5μg/mL的TDH能诱导33％的SPC-A-1细胞发生早期凋亡,并激活caspase-3.结论 TDH可能通过激活caspase-3途径诱导细胞凋亡,从而抑制SPC-A-1细胞的生长和增殖.

目的:开发特异性检测副溶血弧菌耐热直接溶血毒素(TDH)的快速免疫胶体金检测板.方法:利用本实验室前期制备的两株TDH单克隆抗体T6D4和T9H4,以双抗体夹心法研制胶体金检测板.结果:研制出的快速免疫胶体金检测板能够特异性地检测TDH,检测限为500 ng/ml.结论:成功研制出能够特异性检测副溶血弧菌TDH的快速免疫胶体金检测板,为TDH的快速检测提供了新的测试工具.

最近我们制备了二株抗TDH的单克隆抗体（McAb）。其腹水抗体滴度为2~4×10 -5。二株McAb均能抑制TDH的溶血活性。V56-12在体外能中和毒素的毒性作用，注入小鼠体内，能保护小鼠抵抗TDH的攻击。V35-25体外不能中和TDH的毒性作用，注入小鼠体内，也不能保护小鼠抵抗TDH的攻击。此二McAb可能作用于TDH的不同表位，因此在抗感染过程中的作用有所不同。

目的 分析两起食物中毒中副溶血性弧菌分离株的分子分型、耐药性特点,以揭示深圳市龙华区副溶血性弧菌的分子流行特征.方法 对该两起食物中毒事件分离到的28株副溶血弧菌(其中5株分离自2019年5月15日食物中毒患者肛拭子,另外23株分离自2019年9月1日食物中毒患者肛拭子、厨师肛拭子、食物及环境样品)进行血清学分型,PCR检测耐热直接溶血毒素基因(tdh)、耐热相关溶血毒素基因(trh),脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型分析及微量肉汤法检测抗生素敏感性.结果 两起食物中毒副溶血弧菌分离株血清学均以O3∶K6型为主;抗生素敏感性分析显示,仅对头孢唑啉(CFZ)出现耐药或中度敏感,对其他抗生素均敏感;毒力基因PCR检测结果显示,均以tdh+、trh-型菌株为主;经限制性内切酶(NotⅠ)酶切后的DNA指纹图谱,两起食物中毒菌株间的相似值为68.3％～100.0％,按100％相似度可以分为21个型别.结论 不同时间不同地点的食物中毒事件中分离株间具有高度的同源性,同时还发现存在不同血清型的菌株间的DNA指纹图谱存在紧密相关性,提示辖区存在副溶血弧菌的持续污染以及分子水平的变异.

目的 分析上海市奉贤区不同来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况、耐药性和遗传特征,为副溶血性弧菌风险监测预警和溯源提供参考.方法 收集2019年上海市奉贤区腹泻患者和食品风险监测中分离到的副溶血性弧菌,采用三重实时荧光PCR法检测不耐热溶血素基因(tlh)、耐热直接溶血毒素基因(tdh)和耐热相关溶血毒素基因(trh),采用微量肉汤稀释法对分离菌株进行药敏试验,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行聚类分型.结果 56株副溶血性弧菌tlh基因携带率为100.00％;其中35株人源性菌株tdh和trh基因携带率分别为91.43％和8.57％,21株食源性菌株trh基因携带率为4.76％.人源性耐药株22株,耐药率为62.86％;食源性耐药株6株,耐药率为28.57％.人源性中度敏感株21株;食源性中度敏感株9株.PFGE聚类分析结果显示,56株副溶血性弧菌分为31种带型,带型相似性50.37％～100.00％.5组同源性菌株毒力基因和耐药谱均一致.结论 2019年奉贤区分离的56株副溶血性弧菌遗传性较为分散,但存在主要流行克隆系.食源和人源性菌株间遗传差异较大,存在多重耐药和高毒力菌株,引起食源性疾病的风险较高.

目的 分析2017-2019年北京市引起腹泻的副溶血性弧菌血清分型、毒力基因携带情况以及抗菌药物敏感性.方法 对北京市2017-2019年肠道门诊监测中分离到的295株副溶血性弧菌进行血清学分型试验,应用实时荧光PCR方法检测不耐热溶血毒素基因(tlh)、耐热直接溶血毒素基因(tdh)和耐热相关溶血毒素基因(trh,用微量肉汤稀释法进行26种抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)测定.结果 295株副溶血性弧菌有8个O群和19个K型,共28种血清型,以O3∶K6血清型为主,占63.4％(187/295),其次为O4∶KUT,占11.2％(33/295).295株副溶血性弧菌tlh、tdh和trh基因阳性率分别为100.0％ (295/295),91.9％(271/295)和2.4％(7/295).3种毒力基因检测结果可以分成4种类型,tlh+ tdh+ trh-为优势基因型,占90.5％(267/295).药敏试验结果显示,295株分离菌株对阿奇霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、阿莫西林-克拉维酸、米诺环素、亚胺培南、美罗培南和头孢噻肟100％敏感,对头孢唑林、链霉素和氨苄西林耐药率较高,分别为61.4％ (181/295)、14.2％(42/295)和7.1％(21/295).有12株菌出现多重耐药现象,占4.1％(12/295).结论 2017-2019年北京市引起腹泻的副溶血性弧菌有多种血清型,其中以O3∶K6为优势血清型.多数菌株为携带tlh和tdh基因的产毒株.菌株对多数抗菌药物比较敏感,但仍存在多重耐药现象.

目的 建立副溶血弧菌耐热直接溶血素的双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法.方法 本研究通过PCR技术扩增副溶血弧菌耐热直接溶血素基因序列,并将其克隆至pET-28a载体后进行原核表达,对表达蛋白进行纯化和鉴定,随后用高纯度的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,得到抗体后利用分子互作测定抗体的亲和力,并利用该抗体建立检测副溶血弧菌耐热直接溶血素的DAS-ELISA方法.通过棋盘法对该方法的反应条件进行优化,建立标准曲线,并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用.结果 本实验制备的多克隆抗体亲和力可达1×10-8,使用该高亲和力抗体建立的DAS-ELISA方法灵敏度为78 ng/mL,定量范围为78～312 ng/mL;与创伤弧菌溶细胞毒素(Vibrio vulnificus hemolysin,VVH)、产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens a toxin,CPA)以及产气荚膜梭菌ε毒素(epsilon toxin,ETX)均无交叉反应;利用扇贝、花蛤和魁蚶制备海鲜模拟样本,在上述3种模拟样本内添加重组蛋白构建标准曲线,评价本方法复杂基质中检出能力时发现灵敏度均并未发生改变;同时在上述3种模拟样本中添加菌液上清评价本方法检测天然毒素能力,检出率为100％.结论 成功构建了一种用于副溶血弧菌耐热直接溶血素检测的DAS-ELISA方法,该方法特异性强、灵敏度高,适用于复杂基质检测,有望开发成副溶血弧菌耐热直接溶血素快速诊断试剂盒,具有良好的应用前景.