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长脉宽1064 nm Nd∶YAG激光重塑兔耳软骨分子作用机制研究
编辑人员丨5天前
目的:探讨长脉宽1064 nm Nd∶YAG激光照射兔耳软骨后,导致兔耳软骨重塑的分子作用机制。方法:将33只兔按照随机数表法分为6组,分别用于以下实验:筛选激光能量(6只),观察激光照射术后即刻(6只)、1周(6只)、3周(6只)、6周(6只)兔耳软骨组织的变化,以及转录组测序和样本验证(3只)。采用自身对照研究,左耳为不做处理,为正常对照侧;右耳进行激光照射(照射侧)。(1)激光能量筛选:使用长脉宽1064 nm Nd∶YAG激光以不同能量密度(50、60、70、80、90、100 J/cm 2)照射6只兔耳右侧软骨后,取双侧厚度一致、相同规格、去除皮肤及软骨膜的软骨,进行组织学切片HE染色,观察软骨细胞的变化,确定最适宜塑形的激光能量密度(简称最适能量密度)。(2)兔耳软骨组织学观察:采用最适能量密度的激光照射24只兔右耳,分别于术后即刻及1、3、6周取材双侧软骨进行组织学观察(HE、Masson和天狼星红染色)。(3)转录组测序和样本验证:采用最适能量密度的激光照射3只兔右耳,照射后6 h内取下兔耳右侧软骨组织进行混合,设为激光照射组;取左耳相同部位、等体积的软骨组织,设为空白对照组,进行转录组RNA测序,并采用定量聚合酶链式反应(qPCR)和蛋白质印迹法检测相关基因和蛋白的表达。 结果:(1)经50~100 J/cm 2不同能量密度的激光照射后,HE染色显示,激光能量密度为80 J/cm 2时能使软骨细胞有改变但未发生空泡变形及凝固性坏死,损伤程度适宜。(2)80 J/cm 2的激光照射后,组织学观察显示,术后即刻出现激光辐射带,辐射带上软骨细胞整体形态拉长,呈梭形细胞样改变,基质染色深,折光明显,Ⅱ型胶原相对增多,1周时辐射带变浅,细胞大小较前恢复;3周到6周时辐射带周围基质染色又逐渐加深,整体形态又拉长。(3)转录组RNA测序发现:激光照射组与空白对照组相比,有198个差异表达基因(70个基因上调、128个基因下调)。通过进一步筛选和研究,激光照射组中CREB3L2基因表达上调。qPCR结果显示,激光照射组中CREB3L2 mRNA相对表达量明显高于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.01);蛋白质印迹法检测显示,CREB3L2蛋白相对表达量高于空白对照组,且具有时间依赖性,差异有统计学意义( P<0.01)。 结论:长脉宽1064 nm Nd∶YAG激光照射兔耳软骨后,上调了CREB3L2基因的表达,引起软骨细胞重排及增殖,导致耳软骨形态和生物力学发生改变。
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编辑人员丨5天前
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OTOGL基因新变异致隐性遗传中度感音神经性耳聋的表型和基因型分析
编辑人员丨5天前
目的:对两个中度感音神经性耳聋小家系行表型及遗传学分析,明确其致聋病因。方法:对2014年1月至2020年8月间就诊于解放军总医院的两个耳聋小家系进行表型及遗传学分析。对家系1先证者及家系2先证者父母的DNA样本行所有已知耳聋基因二代测序,并对变异位点在家系成员中进行Sanger测序验证。对已报道的耳胶样蛋白(OTOGL)基因致病变异位点、导致中度感音神经性耳聋的常染色体隐性遗传性耳聋基因和与OTOGL基因具有相同表达定位的耳聋基因的临床表型进行分析和总结。结果:两个耳聋家系先证者(均为男性患儿)的致病变异分别为OTOGL基因c.2773C>T/c.2826C>G(p.Arg925*/p.Tyr942*)和c.4455G>A/c.875C>G(p.Trp1485*/p.Ser292*)复合杂合变异,其中c.2773C>T为文献已报道的致聋变异位点,c.2826C>G、c.4455G>A和c.875C>G为新发现的变异位点,根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)制定的变异解读标准,上述4个变异位点分类均为致病变异。结论:OTOGL基因变异是导致中度感音神经性聋的重要遗传因素,本研究新发现的c.2826C>G、c.4455G>A和c.875C>G变异位点丰富了该基因的基因变异谱,为耳聋家系的遗传咨询提供了依据,并为遗传性耳聋的治疗提供了新的靶点。
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编辑人员丨5天前
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微小RNA-296在兔增生性瘢痕中的表达及对人成纤维细胞的作用
编辑人员丨5天前
目的:探讨微小RNA-296(miR-296)在兔增生性瘢痕中的表达及对人成纤维细胞(HFb)的作用。方法:采用实验研究方法。将12只雌雄不限成年新西兰长耳兔按完全随机法分为正常对照组和瘢痕组,每组6只。瘢痕组根据文献制作兔耳增生性瘢痕模型,正常对照组兔不行任何处理。于瘢痕组建模后60 d,采用苏木精-伊红染色法观察2组兔耳瘢痕/皮肤组织中成纤维细胞(Fb)生长与排列,采用实时荧光定量反转录PCR法检测2组兔耳瘢痕/皮肤组织中miR-296和转化生长因子β 1(TGF-β 1)的mRNA表达量,另对miR-296与TGF-β 1mRNA表达量的相关性进行Pearson回归分析。取2批HFb,第1批分为TGF-β 1野生型+miR-296阴性对照组和TGF-β 1野生型+miR-296模拟物组,第2批分为TGF-β 1突变型+miR-296阴性对照组和TGF-β 1突变型+miR-296模拟物组,分别转染对应的序列。转染后48 h,采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测每组细胞TGF-β 1的荧光素酶和肾荧光素酶的表达,以其比值反映基因表达水平。取2批HFb,每批细胞均分为miR-296阴性对照组和miR-296模拟物组,分别转染对应序列。第1批细胞转染后0(即刻)、12、24、36、48 h,采用噻唑蓝法检测细胞增殖情况。第2批细胞转染后24 h,采用蛋白质印迹法检测细胞中TGF-β 1和Ⅰ型胶原蛋白表达情况。细胞实验中样本数均为3。对数据行析因设计方差分析、独立样本 t检验。 结果:瘢痕组建模后60 d,瘢痕组兔耳瘢痕组织中Fb过度增生且排列紊乱,正常对照组兔耳皮肤组织中Fb生长与排列无异常;瘢痕组兔耳瘢痕组织中miR-296的mRNA表达量(0.65±0.11)显著低于正常对照组兔耳皮肤组织(1.19±0.12, t=5.175, P<0.01),瘢痕组兔耳瘢痕组织中TGF-β 1的mRNA表达量(1.47±0.06)显著高于正常对照组兔耳皮肤组织(1.10±0.03, t=12.410, P<0.01)。Pearson回归分析显示,12只兔耳瘢痕/皮肤组织中miR-296和TGF-β 1的mRNA表达量呈明显负相关( F=7.278, P<0.05)。转染后48 h,TGF-β 1野生型+miR-296模拟物组细胞TGF-β 1的基因表达明显低于TGF-β 1野生型+miR-296阴性对照组( t=35.190, P<0.01),2个TGF-β 1突变型组TGF-β 1基因表达相近( P>0.05)。miR-296模拟物组细胞增殖能力在转染后12、24、36、48 h明显低于miR-296阴性对照组( t=3.275、11.980、10.460、17.260, P<0.05或 P<0.01)。转染后24 h,miR-296阴性对照组细胞TGF-β 1和Ⅰ型胶原的蛋白表达量均明显高于miR-296模拟物组( t=3.758、29.390, P<0.05或 P<0.01)。 结论:兔增生性瘢痕中miR-296表达下调,miR-296能够通过下调TGF-β 1的表达抑制HFb的增殖和Ⅰ型胶原蛋白的表达。
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编辑人员丨5天前
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股骨干骨折后过度生长动物模型制作及差异蛋白质组学研究
编辑人员丨5天前
目的:建立股骨干骨折后过度生长动物模型,并通过蛋白质组学研究观察骺板的差异表达蛋白,以期明确股骨干骨折后过度生长的生物学机制。方法:取48只雄性6周龄日本大耳白兔,利用环形剥离股骨干骨膜的方法建立兔股骨干骨折后过度生长动物模型,右侧为手术侧,左侧为假手术侧。术后4周取术侧及假手术侧股骨测量全长,并取股骨远端骺板行串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)定量蛋白质组学分析,通过对差异蛋白行基因本体(gene ontology,GO)分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析研究相关蛋白表达变化。另取20只10周龄雄性日本大耳白兔作为空白对照组,测量其双侧股骨长度。对相关差异蛋白行蛋白质印迹法检测。股骨长度差及蛋白表达差异采用Kolmogorov-Smirnov检验验证正态性,F检验验证方差齐性,符合正态分布且方差齐,采用配对 t检验比较分析两侧股骨长度,独立样本 t检验比较分析手术组与空白组长度差,若不符合正态分布或方差不齐采用秩和检验。GO功能富集分析应用Fisher精确检验。 结果:术后4周,手术组双侧股骨长度差(手术侧-假手术侧)为(0.62±0.63)mm,空白组双侧股骨长度差(右侧-左侧)为(-0.025±0.26)mm,组间比较,差异有统计学意义( P<0.001)。共鉴定出283种差异蛋白,GO分析提示差异蛋白富集于细胞代谢、胞内结构、有机环状化合物结合等,KEGG富集提示差异蛋白通路集中于核糖体、蛋白质外排、剪切体、细胞凋亡及内质网中蛋白质加工等。蛋白质印迹法检测提示X型胶原蛋白α1链(type X collagen alpha 1 chain,COL10A1)在过度生长的股骨远端骺板软骨中表达上调。 结论:通过骨膜环切法可建立股骨过度生长的动物模型,COL10A1可能参与股骨过度生长的生物学行为。
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编辑人员丨5天前
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寡脂肪及乏脂肪型梭形细胞脂肪瘤6例临床病理学分析
编辑人员丨5天前
目的:探讨寡脂肪及乏脂肪型梭形细胞脂肪瘤(LF-FFSCL)的临床病理学、免疫组织化学及分子遗传学特征和鉴别诊断要点。方法:收集南京医科大学第一附属医院2014—2022年诊断的6例LF-FFSCL临床组织形态学特点及免疫组织化学结果,对3例肿瘤组织采用荧光原位杂交(FISH)检测RB1基因的缺失状态,复习相关文献进行分析。结果:6例患者中男性5例,女性1例,发病年龄34~68岁,中位年龄56岁。发病部位情况:背部2例,颈部、口腔、耳后及臀部各1例。4例肿瘤表现为皮下孤立界清无痛性结节,1例位于真皮内,1例位于舌下;镜下观察,肿瘤主要由形态温和的梭形细胞组成,呈无序或平行短束状排列,肿瘤间质呈纤维或黏液状,可见显著的绳索样胶原束和肥大细胞浸润;肿瘤内脂肪组织较少,其中2例无脂肪成分,其余4例脂肪成分均<5%。肿瘤内的梭形细胞弥漫强阳性表达CD34,RB1蛋白表达缺失,Ki-67阳性指数低;不表达S-100蛋白、SOX10、平滑肌肌动蛋白、STAT6、结蛋白、雌激素受体及上皮细胞膜抗原。分子病理检测显示RB1基因缺失。结论:LF-FFSCL是一种罕见的梭形细胞脂肪瘤组织学亚型,较易误诊,认识并熟悉其形态学特征结合免疫组织化学检查有助于其诊断与鉴别诊断,RB1基因检测亦可作为重要的辅助诊断手段。
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编辑人员丨5天前
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基于噬菌体展示技术醛固酮特异性抗体的筛选
编辑人员丨2024/4/27
目的 利用噬菌体展示技术及重组抗体构建技术筛选出特异性醛固酮(ALD)抗体,为ALD诊断试剂盒的研发提供原材料.方法 取5只健康清洁级新西兰大白兔,将抗原ALD-血蓝蛋白(KLH)稀释至2 mg·L-1,采用背部多点注射方法对5只新西兰大白兔进行首次免疫,免疫剂量为每只1 mg;每隔2周进行1次免疫,且免疫剂量减少50%;从第3次免疫开始,每次免疫1周后采集大白兔耳缘静脉血,使用包被0.25 mg·L-1ALD-BSA抗原的化学发光板,采用间接法和竞争法测定血清滴度;第5次免疫后选取血清效价高、特异性好的大白兔,取其脾脏和骨髓等组织.将脾脏组织研磨,采用TRIzol试剂一步法提取RNA,获取轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因序列.通过连接肽连接成单链片段(ScFv)并构建至噬菌粒载体Pcomb3xss中;然后,通过电转化方法将其导人大肠杆菌TG1,完成ALD ScFv噬菌体展示库构建.对文库进行3~5轮富集筛选,并挑取单克隆进行噬菌体上清制备,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)竞争法鉴定后送测,获得高竞争性克隆序列;将筛选得到的克隆序列插入至pCMV3表达载体,提取质粒后使用瞬时转染方法进行HEK293细胞转染;1周后,收取上清,应用亲和层析纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳鉴定其纯度及表达量.结果 5只大白兔在第5次免疫后,间接法检测其血清效价结果显示,4#、5#大白兔血清在稀释32 000倍后,效价仍>10 000.竞争法检测结果显示,5#大白兔血浆样本低值与高值的比值为2:1,优于其他大白兔.选取5#大白兔进行噬菌体文库构建.使用常规聚合酶链反应扩增出VL及VH基因片段,经搭桥拼接成ScFv(VL+VH)后,琼脂凝胶电泳分析可看到750 bp左右大小条带,与最初设计的片段大小一致.ScFv经酶切连接电转至大肠杆菌TG1中,构建一个库容为4.73 ×108 cfu·mL-1的噬菌体文库.经3轮淘洗出库平皿挑取300个单克隆,制备单克隆噬菌体,ELISA结果显示,300个克隆中阳性率达100%,校准品竞争检测阳性克隆42个,筛出率14%;42个阳性克隆进一步进行临床样本竞争检测,筛出16株单克隆符合要求,将16株进行复测,2次检测结果一致;测序后优选6条抗体序列进行构建表达,纯化后SDS-PAGE还原胶电泳结果显示,在重链50 000及轻链25 000位置均有条带,获得6株高亲和力、竞争性的兔ALD单抗.结论 通过噬菌体展示技术成功筛选出6株高亲和力、竞争性的兔ALD抗体,这为小分子抗体的发现提供了一种参考方法.筛选出的AD185、AD277抗体在校准品及临床样本竞争中,均表现出比阳性对照高出2倍的竞争优势,这为ALD检测试剂盒原材料的开发提供了可能性.
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编辑人员丨2024/4/27
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男性新生儿局灶性真皮发育不良综合征一例及文献复习
编辑人员丨2023/8/6
目的 结合文献探讨儿童局灶性真皮发育不良综合征(focal dermal hypoplasia, FDH)的临床及基因学特点. 方法 分析首都医科大学附属北京儿童医院新生儿病房收治的1例新生儿FDH男性患儿的临床资料、辅助检查、病理组织学检查特点、基因检测结果,并检索复习PubMed数据库、万方数据库、中国知网数据库建库至2018年3月报道的临床资料相对完整的儿童期确诊为FDH的文献,总结该病的特点. 结果 本文报道1例新生儿期确诊的FDH男性患儿.该患儿具有典型皮肤、骨骼、牙龈、双眼虹膜及瞳孔受累表现,同时有小头畸形、双侧耳廓软骨发育不良、牙胚发育不全、双足畸形.皮肤病理组织学检查提示真皮发育不良.基因检测显示PORCN基因c.268C>T的疑似嵌合核苷酸变异,患儿父母及其姐姐未见异常.回顾复习中英文文献及本例报道,儿童期确诊FDH病例共60例,其中19例新生儿期确诊,57例(95.0%)患儿均出现典型的皮肤发育不良表现,56例(93.3%)出现骨骼畸形,而其他临床表现多样.病理组织学检查提示真皮发育不良,脂肪组织上移,附属器、胶原纤维减少.其中有19例患儿(新生儿期起病者4例)进行了基因学检测,检测结果均提示PORCN基因突变.4例新生儿期起病者,基因检测结果分别为c.956dupA、c.1061T>C、c.749C>T、c.268C>T.本例患儿为男性,仅有1条X染色体,此基因突变会直接影响基因功能,导致表型异常,其父母并未检测出突变,因此患儿为原发突变. 结论FDH是一种累及多系统的遗传性疾病,临床表现多样,应尽早进行皮肤病理组织学检查及基因检测,以便早诊断早干预.准确的诊断对遗传咨询、生殖规划、预期指导和预后至关重要.
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编辑人员丨2023/8/6
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慢性房颤心房肌细胞成分结构的基因本体法分析
编辑人员丨2023/8/6
目的 应用基因本体法研究慢性房颤心房肌细胞成分分子病理异常.方法 选择接受二尖瓣置换术的二尖瓣狭窄为主的48例风湿性心脏病患者,其中慢性房颤24例(慢性房颤组)、窦性心律24例(窦性心律组).取两组右心耳心肌,采用Western blotting法检测钙调蛋白(CaM)表达,应用全基因组表达谱芯片检测技术,获取数据行主成分、系统聚类及细胞组件基因本体分析.结果 慢性房颤组、窦性心律组心房肌组织中CaM相对表达量分别为0.199±0.058、0.135±0.034,两组相比P<0.05.主成分分析显示,慢性房颤组和窦性心律组心房肌样本在二维空间上明确分布于不同的区域;系统聚类将所有样本聚为慢性房颤和窦性心律两类;DIVID系统在线分析显示,慢性房颤和窦性心律差异表达基因在细胞成分本体有肌原纤维、细胞外基质、胶原三聚体等37个注释条目异常;注释条目富集聚类显示,心房肌结构受房颤影响依次为细胞外成分、收缩纤维及细胞骨架等.结论 慢性房颤与窦性心律心房肌基因表达模式明显不同,慢性房颤心房肌细胞外结构、收缩纤维、细胞骨架、细胞膜、膜锚蛋白、内质网、线粒体、脂肪及脂蛋白颗粒等细胞成分在分子水平与窦性心律心房肌存在明显异常.
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编辑人员丨2023/8/6
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低强度脉冲超声对浅层关节软骨损伤的作用
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨低强度脉冲超声(LIPUS)对浅层关节软骨(p-AC)损伤的作用.方法 选择健康日本大耳白兔16只,雌雄不限,体质量2.5~3.3 kg.手术创建兔膝关节p-AC损伤,使用功率30 mW/cm2、脉冲通断比20%、脉冲频率1 kHz、超声固有频率1.5 MHz的LIPUS进行术后处理,每天20 min.于LIPUS处理1周和3周,用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测损伤周围软骨组织mRNA的表达;处理6周和12周后,对损伤处进行组织学评估.分离、培养关节软骨细胞并进行LIPUS处理,分别在干预后第1、3、5天,检测软骨细胞的增殖及基因表达情况.结果 在该实验参数下,6周和12周实验组和对照组均没有透明样软骨再生,但是对照组的白色纤维组织较多;与对照组相比,LIPUS下调了软骨组织中Ⅰ型胶原的基因表达,但是差异无统计学意义(P>0.05);在第1周时下调Ⅱ型胶原的表达(P=0.046);在第3周时下调蛋白多糖(ACAN) (P=0.017)、SOX9(P=0.001)的表达.组织学病理切片分析发现LIPUS没有促进p-AC修复;但是,与对照组相比,LIPUS对钙化软骨(CC)层与软骨下骨(SB)层有一定的保护作用.最后LIPUS在体外第5天时显著抑制软骨细胞增殖(P=0.002 3),不能促进Ⅱ型胶原和ACAN的表达,但可以下调MMP-13的表达并在第5天时差异有显著统计学意义(P=0.000 036).结论 在该实验条件下,LIPUS对p-AC损伤无明显的修复作用,但具有一定的组织保护和减弱组织退化的作用.
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编辑人员丨2023/8/6
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立显蛋白染色液在SDS-PAGE中检测微量蛋白的应用
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨立显蛋白染色液在SDS-PAGE中检测微量蛋白的应用效果.方法 制备SDS-PAGE胶,采用立显蛋白染色液及普通考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue,CBB)染色液,检测定量的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的敏感度及猪细小病毒VP2蛋白、猪蓝耳病病毒N蛋白、猪丹毒杆菌Fe蛋白和猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因工程纯化样品的纯度.结果 采用立显蛋白染色液染色可识别蛋白质含量为2.5ng的蛋白条带,敏感性高于普通CBB染色40倍.4种蛋白纯化样品经CBB染色后检测纯度均较高,但经立显蛋白染色液染色后,4种纯化蛋白样品均检测出杂蛋白,测定的纯度均有所下降,其中VP2及gB蛋白的纯度有较大幅度下降(分别由83.33%、100%降至51.8%、85.6%).结论 立显蛋白染色液染色SDS-PAGE胶中的蛋白条带敏感性高,快速简便,适用于微量蛋白质的检测.
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编辑人员丨2023/8/6
