目的 探索阴沟肠杆菌SHAMU191747所分泌的新型R 型噬菌体尾样细菌素(phage tail-like bacteriocin,PTLB)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococ-cus aureus,MRSA)的抗菌活性.方法 琼脂平板拮抗试验和肉汤微量发酵试验,检测阴沟肠杆菌SHAMU191747对MRSA的拮抗活性.超高速离心法和密度梯度离心法,制备阴沟肠杆菌SHAMU191747发酵上清液粗提物.使用透射电镜检测粗提物中有无新型R型PTLB.琼脂平板点种法,验证粗提物对MRSA的抗菌活性.采用SDS-PAGE电泳检测新型R型PTLB的分子量.结果 阴沟肠杆菌SHAMU191747分泌新型R型PTLB,对MRSA具有强拮抗效应.新型R型PTLB的分子量约35 ku,能够高效杀伤MR-SA;尾鞘未收缩的功能性分子的物理尺寸为(142.7±4.3)×(13.8±0.6)nm,尾鞘收缩的非功能性分子的物理尺寸为(57.7±1.2)×(20.8±1.5)nm.结论 阴沟肠杆菌SHAMU191747产生的新型R型PTLB能够高效杀伤MRSA,具有开发成新型抗菌药物的潜力,临床应用前景很大.

目的 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)精制抗原纯度,并进行验证.方法 对样品进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后,使用凝胶成像系统拍照并用Image Lab软件进行分析,获得样品各蛋白条带的光密度值.对建立的方法进行系统适用性、线性、准确度、重复性、中间精密度、灵敏度和耐用性验证.结果 对应 2 套分子量标准蛋白,PT、FHA和PRN精制抗原分别在10.00～50.00 μg/mL的低质量浓度范围和 50.00～600.00 μg/mL的高质量浓度范围内,蛋白浓度和对应条带光密度值之间具有良好的线性关系,相关系数(coefficient of correlation,r)≥0.99.3 种精制抗原杂质水平准确度和重复性回收率均在 80%～120%,且重复性验证相对标准差(relative standard deviation,RSD)≤10%;抗原水平准确度和重复性回收率均在90%～110%,重复性验证RSD≤10%;灵敏度 12.50 μg/mL的回收率均在 80%～120%,RSD≤10%;中间精密度验证RSD≤10%.结论 建立的测定PT、FHA和PRN精制抗原纯度的SDS-PAGE法,其系统适用性、准确度、重复性、中间精密度和灵敏度均良好,可用于以上精制抗原的纯度检测.

目的 制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus re-ceptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性.方法 用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sor-ting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用 Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG 细胞和 293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度.结果 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度＞95％;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95.采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均＞90％.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.168 70 μg/mL 和 0.038 65 μg/mL,与 293T-cyno-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.037 14 μg/mL 和 0.031 98 μg/mL,与 Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为 1.74E-10M 和 1.69E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体和 TIGIT 的人源化抗体 hT1 与 293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.070 27 μg/mL 和 0.031 21 μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line 的 EC50 分别为 0.020 28μg/mL 和 0.028 22 μg/mL;与 Human TIGIT Protein,His Tag 的亲和力为 8.50E-10M 和 8.47E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体具有阻断 PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG 相互作用活性,且 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 的 EC50为 0.007 μg/mL,优于单独人源化抗体 hT1(EC50为 0.013 μg/mL)和 hP1(EC50为 0.048 μg/mL)的作用.在含 pp65 peptide 条件下 KY-TIGIT-h1gG4M-PVRIG-SCFV 抗体分泌 IFN-r 为 349.72 pg/mL,明显高于其他抗体.结论 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物.

目的 制备用于肿瘤光热治疗的载吲哚菁绿(ICG)血小板膜仿生纳米粒(ICG-PLP),并对其体外特性进行初步评价.方法 采用超声法制备ICG-PLP,并用激光粒度仪测定其粒径及zeta电位,用紫外分光光度法检测其包封率,在808 nm近红外光(2 W/cm2)照射下考察其光热性质,用SDS-PAGE观察血小板膜蛋白保留情况,用激光共聚焦显微镜考察制剂被小鼠巨噬细胞RAW264.7及人非小细胞肺癌细胞A549、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10、小鼠乳腺癌细胞4T1摄取的情况,用MTT法检测ICG-PLP光毒性,通过考察溶血率及细胞相容性初步评价其安全性.在健康SD大鼠体内尾静脉注射给药后考察ICG、载ICG脂质体和ICG-PLP的体内循环时间.结果 成功制备了ICG-PLP,其平均包封率为(97.68±0.01)％,平均粒径为(109.77±0.76)nm,平均zeta电位为(-21.23±0.84)mV,多分散系数为0.22±0.01.ICG-PLP很好地保留了血小板膜上的蛋白质,并具有良好的光热性能.血小板膜能促进仿生纳米粒被A549、B16-F10、4T1等肿瘤细胞摄取,并减少巨噬细胞对仿生纳米粒的吞噬.ICG-PLP展示出良好的光热治疗效果,能杀伤肿瘤细胞,且有良好的安全性.静脉给药后,ICG-PLP能延长ICG在健康SD大鼠体内的滞留时间.结论 成功构建了ICG-PLP,其在药物靶向递送和肿瘤光热治疗方面具有很大的潜力.

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:分析肺炎链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶StkP胞外区(EC-StkP)基序(motif)在与β-内酰胺类抗生素结合中的作用。方法:分别将EC-StkP的3个motif(SXXK)依次和全部突变为AXXA，将突变后得到的质粒导入受体细胞进行克隆表达，SDS-PAGE联合凝胶图像分析系统检查目的重组突变蛋白(EC-rStkP)表达情况，Ni-NTA亲和层析法分别提纯突变蛋白。采用等温滴定量热法(ITC 200)和表面等离子共振法(Biacore t200)检测突变蛋白与青霉素(PCN)和头孢噻肟(CTX)结合能力。结果:PCN和CTX均不能与第1个、第3个以及3个motif均突变的蛋白质结合，但第2个motif突变后还能与CTX有较弱结合，而与PCN却不能结合。结论:肺炎链球菌StkP激酶胞外区的3个motif都能与β-内酰胺类抗生素结合，且以与第1个motif和第3个motif结合为主。

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

目的:构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因（CPI502/GAPDH720）真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720，并观察其在人宫颈癌细胞（Hela细胞）中的蛋白表达。方法:根据T细胞表位预测的基因序列设计引物，以质粒pGEM-T-CPI621为模版，利用反转录PCR（RT-PCR）扩增目的基因片段，将该片段克隆至原核表达质粒pET-28a（+）中，构建原核表达质粒pET28a（+）-BmCPI502。根据软件设计合适引物，RT-PCR分别扩增BmCPI502基因和BmGAPDH720基因，pcDNA3.1（+）、BmCPI502、BmGAPDH720分别进行双酶切后进行连接，构建复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720。将复合表位基因重组质粒转染至Hela细胞后，进行RT-PCR验证，获得与预期相符目的条带；将表达产物利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测。结果:获得了原核表达重组质粒pET28a（+）-BmCPI502，经酶切鉴定得到502 bp特异性片段，与预期值符合；成功构建了复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720，酶切鉴定所产生的片段大小与预期符合；复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720转染Hela细胞后得到稳定表达，SDS-PAGE鉴定分析显示重组蛋白相对分子质量（ Mr × 10 3）约为50。 结论:成功构建了周期型马来丝虫复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720，并在真核细胞中获得相应的重组蛋白，为进一步研究重组蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。

目的:制备一种针对整合素αM(CD11b)受体的预定位分子探针 68Ga-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酸-精氨酸-谷氨酸-十一聚乙二醇-1，2，4，5-四嗪/CD11b抗体片段-反式-环辛烯[ 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz/anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO]，并通过microPET显像探讨其作为CD11b受体靶向分子探针的可行性。 方法:采用免疫荧光法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7膜表面CD11b受体的表达情况。将CD11b抗体与TCO连接，并通过酶切法得到anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO。对配体NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz进行 68Ga标记，检测标记率以及放化纯。进行预定位细胞结合实验，建立CT26结肠癌荷瘤裸鼠模型，进行预定位生物分布以及microPET显像实验。用免疫组织化学检查验证肿瘤微环境中CD11b +细胞的浸润情况。用单因素方差分析比较组间差异。 结果:免疫荧光检测结果显示RAW264.7细胞膜表面高度表达CD11b受体。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证成功合成anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO。放射性配体 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz标记率约为94.6%，比活度为7.0~7.4 MBq/μg，放化纯大于95%。预定位细胞结合实验证实该分子探针与CD11b受体有较好的靶向性。生物分布及显像结果示，在预定位4、12以及24 h时间间隔下，模型鼠肾放射性摄取较高，表明分子探针通过肾代谢；肿瘤/肌肉比值为9.23±1.45、12.53±1.36和10.74±1.11( F＝848.8， P<0.05)；在预定位12 h注射放射性配体后1 h显像，肿瘤与非靶器官对比度最佳：肿瘤标准摄取值(SUV)为0.67±0.12，肌肉SUV为0.09±0.04。免疫组织化学结果示，CT26结肠癌微环境中浸润了大量CD11b +细胞。 结论:成功合成预定位分子探针 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz/anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO，该标记物对CD11b阳性结肠癌具有较强的靶向能力，有望用于靶向CD11b受体的体内示踪。

目的:获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原，并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法:人工合成密码子优化的 GTV-NP 编码基因，克隆至 pET32a（+）载体，构建重组表达质粒，转化至 BL21（DE3）。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原，建立并优化GTV IgG抗体间接ELISA检测方法，并对其进行评价和初步应用。结果:成功构建原核表达质粒pET32a-NP，重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达，大小约为44 kD，Western blot结果表明重组蛋白与GTV阳性血清具有良好的抗原性。建立的ELISA法特异性强、敏感性高、批内和批间的变异系数均小于10%具有较好的重复性；检测结果与IFA检测结果符合率达到92.77%。结论:建立的GTV NP 抗体检测ELISA方法的敏感性、重复性和特异性均较好。