目的:本研究旨在探索铅染毒是否会导致斑马鱼焦虑的发生，并对其机制进行初步探索。方法:于2020年5月，收集受精后4 h（4hpf）的斑马鱼胚胎，以E3培养液作为对照组，不同的铅染毒浓度（6、12、24、48 μmol/L）作为染毒组，染毒时间为140 h。计算144 hpf斑马鱼的胚胎死亡率、胚胎孵化率和幼鱼畸形率；观察144 hpf幼鱼的行为学变化（运动速度、移动距离、活跃度、绝对转角、光照惊恐反应、黑暗逃避反应和趋触性）。并且检测斑马鱼幼鱼头部的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平。用ELISA试剂盒检测与焦虑相关的神经递质5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NA）和促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的表达量。结果:12、24和48 μmol/L铅染毒组斑马鱼胚胎死亡率高于对照组，胚胎孵化率低于对照组，24和48 μmol/L铅染毒组斑马鱼幼鱼畸形率高于对照组（ P<0.01）；24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼运动速度、活跃度和趋触性低于对照组，绝对转角高于对照组，48 μmol/L铅染毒组幼鱼移动距离和黑暗逃避反应低于对照组，12、24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼的光照惊恐反应低于对照组（ P<0.05）。24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼头部ROS水平和MDA浓度高于对照组（ P<0.05）；12、24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼头部NA和DA的含量低于对照组，24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼头部5-HT和CRH浓度高于对照组（ P<0.05）。 结论:铅对斑马鱼有一定的胚胎发育毒性，且可导致斑马鱼发生焦虑样神经行为、神经递质改变以及氧化应激的发生。

目的:利用微团培养和胚胎干细胞试验评价二硝酰胺铵（ADN）潜在的胚胎发育毒性，并评估其是否为致畸物。方法:于2018年9月，分离大鼠胚胎并收集肢芽细胞，使用不同浓度（0、312.50、625.00、1 250.00、2 500.00、5 000.00、10 000.00 μg/ml）ADN进行染毒，计算细胞半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度并评价ADN致畸作用。在胚胎干细胞试验中，检测不同浓度（0、39.06、78.13、156.25、312.50、625.00、1 250.00、2 500.00 μg/ml）ADN对小鼠胚胎干细胞（mESCs）向心肌细胞分化的抑制作用，以及对mESCs和3T3细胞的细胞毒性，并评价其胚胎毒性。以已知的强胚胎毒性药物5-氟尿嘧啶和非胚胎毒性药物青霉素-G为试验材料，对模型的有效性进行验证，并采用验证性试验模型评价ADN的胚胎毒性。结果:微团培养试验中，各个浓度ADN组大鼠胚胎肢芽细胞增殖抑制率和分化抑制率均高于对照组（ P<0.05）；ADN对肢芽细胞的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为7 480.32和4 526.09 μg/ml，判定ADN为非致畸物。胚胎干细胞试验中，各个浓度ADN组mESCs增殖抑制率高于对照组，156.25、312.50、625.00、1 250.00、2 500.00 μg/ml ADN组3T3细胞增殖抑制率高于对照组（ P<0.05）。ADN对mESCs的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为1 851.73、1 796.39 μg/ml，对3T3细胞的半数增殖抑制浓度为3 334.35 μg/ml，判定ADN为无胚胎毒性。 结论:经微团培养和胚胎干细胞试验模型评价，ADN无胚胎毒性，属于非致畸物。

目的:探讨磷酸三（2-氯丙基）酯（TCIPP）和磷酸三正丁酯（TnBP）对斑马鱼胚胎的生长发育毒性及潜在分子机制。方法:以斑马鱼为模型，采用半静态法，将受精后2 h（hpf）斑马鱼胚胎暴露于TCIPP和TnBP（0.1、1、10、100、500和1 000 μmol/L）水溶液120 h，测定其生存率和孵化率，以及环境相关浓度（0.1和1 μmol/L）下120 hpf斑马鱼转录组的变化。结果:TCIPP和TnBP对斑马鱼胚胎的半数致死浓度分别是155.30和27.62 μmol/L（96 hpf）、156.50和26.05 μmol/L（120 hpf）。暴露于100 μmol/L的TCIPP和10 μmol/L的TnBP后斑马鱼72 hpf孵化率分别为（23.33±7.72）%和（91.67±2.97）%，与对照组相比均降低，差异有统计学意义（均 P<0.05）。转录组结果显示，TnBP暴露导致的差异基因数多于TCIPP，并呈现“剂量-效应”关系。IPA通路富集分析提示共富集32条通路，涉及氧化应激、能量代谢、脂质代谢和核受体相关通路等。TCIPP和TnBP共同富集到3条通路，分别为甲状腺激素受体/视黄酮X受体和组成型雄烷受体/视黄酮X受体通路等。TnBP单独富集到肝脏X受体/视黄酮X受体和氧化应激相关通路等。 结论:TCIPP和TnBP对斑马鱼均具有生长发育毒性，TnBP毒性效应更强，TCIPP和TnBP诱导斑马鱼生长发育毒性的作用机制有所不同。

目的:探讨体内邻苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）暴露水平对不孕患者早期助孕结局的影响及其对小鼠早期胚胎发育的影响。方法:本研究选取2019年2月至10月期间在河南省人民医院生殖中心就诊的因输卵管因素行体外受精-胚胎移植（ in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治疗的患者，根据病历号尾号抽取单号的112例不孕患者为研究对象，应用高效液相色谱串联质谱检测尿液中DBP代谢产物邻苯二甲酸单丁酯（mono-n-butyl phthalate，MBP）的浓度，采用多元回归模型分析尿液中MBP水平与不孕患者受精率、优质胚胎率及囊胚形成率等早期助孕结局的关系。同时将40只3周龄清洁级ICR雌性小鼠简单随机抽样分为对照（玉米油）组和低、中、高剂量DBP染毒组（300 mg/kg、600 mg/kg、1200 mg/kg）四组，每组10只。将各组雌鼠促排卵与非染毒雄鼠合笼后，取受精卵，比较各组间胚胎卵裂率、囊胚形成率和着床位点的差异。 结果:在控制了混杂因素后，患者尿液中MBP浓度与受精率、优质胚胎数、囊胚形成数及囊胚形成率呈负相关（ P=0.01、 P=0.04、 P=0.03、 P=0.05）。DBP低剂量组、中剂量组、高剂量组的小鼠受精后胚胎卵裂率［58.38%（115/197）、43.42%（99/228）、36.60%（71/194）］、囊胚形成率［54.78%（63/115）、44.44%（44/99）、39.44%（28/71）］及胚胎着床位点数（12.20±3.03、11.80±2.68、11.60±2.41）明显低于对照组小鼠［87.12%（142/163）， P<0.001；86.62%（123/142）， P<0.001；16.80±0.84， P<0.001）。DBP低剂量组卵裂率高于中剂量组、高剂量组，差异有统计学意义（ P=0.002， P<0.001）。DBP低剂量组囊胚形成率高于DBP高剂量组，差异有统计学意义（ P=0.042）。DBP染毒的三组小鼠之间胚胎着床位点数差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:DBP暴露与不孕女性临床结局存在相关性，且DBP暴露对小鼠早期胚胎发育产生毒性损伤。

目的 总结国家药物安全评价监测中心2013-2022年SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验各指标的正常值范围,建立SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验各指标的背景数据库,为药物胚胎-胎仔发育毒性评价提供参考.方法 对本中心2013-2022年11项SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验中对照组共计205只孕鼠和3037只胎鼠各项胚胎发育和胎仔生长发育指标进行统计分析,计算其平均数、标准差、变异系数和95%置信区间.指标包括孕鼠妊娠期体重和体重增长幅度、孕鼠摄食量、妊娠结局(妊娠率、平均黄体数、平均着床数、平均活胎数、活胎率、吸收胎率、死胎率)、胎仔生长发育情况(胎仔重、胎盘重、性别比)、胎仔外观异常率、内脏异常率和骨骼异常率.结果 孕鼠妊娠期体重呈增长趋势,妊娠后期体重增长幅度明显增大.孕鼠摄食量随着妊娠时间的增加呈增长趋势.妊娠第20天进行剖腹产,妊娠率为93.2%,平均黄体数、着床数和活胎数分别为18.0±3.2,15.9±2.8和14.8±3.0,活胎率为93.4%,死胎率为6.6%;胎仔雄/雌性别比为0.94,平均体重为(3.6±0.3)g,胎盘平均重量为(0.6±0.3)g.胎仔外观异常发生率约为0.2%,内脏异常率约为0.8%.骨骼异常率约为1.2%,未骨化和骨化不全的发生率较高,主要发生于胸骨和舌骨等,胎仔的掌骨骨化数、跖骨骨化数和骶尾椎骨化数分别为7.0±0.7,8.0±0.1和7.4±0.5,第Ⅰ～Ⅳ胸骨骨化率较高,平均为98.6%～99.9%,第Ⅴ胸骨骨化率为(68.0±28.4)%,第Ⅵ胸骨骨化率为(82.8±23.9)%.结论 初步建立了本GLP实验室SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验中各指标背景数据库,为生殖毒性研究提供参考.

目的 研究小檗碱对肿瘤干细胞增殖的体外抑制作用机制,并评价其体内安全性.方法 采用流式细胞术从小鼠皮肤黑色素瘤B16F10细胞中分选肿瘤干细胞;以CD44、CD133、Nanog同源盒蛋白(NANOG)、八聚体结合转录因子4(OCT4)为指标对肿瘤干细胞进行表征.将肿瘤干细胞分为对照组、全反式维甲酸(ATRA)组和小檗碱组,采用CCK-8法检测小檗碱对肿瘤干细胞活力的影响;采用流式细胞仪检测细胞凋亡率、CD44+/CD133+细胞比例和性别决定区Y框蛋白2(SOX2)阳性细胞率;记录小檗碱处理后肿瘤球的形态变化;记录各组细胞焦亡形态图并检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率,采用Western blot法检测焦亡相关蛋白消皮素E(GSDME)、消皮素E氮端(GSDME-N)、胱天蛋白酶3(caspase-3)和裂解胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)的蛋白表达水平.采用斑马鱼胚胎毒性实验对小檗碱的体内安全性进行初步评价.结果 与B16F10细胞比较,肿瘤干细胞中CD44+/CD133+细胞比例和NANOG、OCT4荧光强度均显著升高(P＜0.000 1).小檗碱对肿瘤干细胞的半数抑制浓度为50.98 μmol/L;与对照组比较,小檗碱组细胞凋亡率显著升高,CD44+/CD133+细胞比例和SOX2阳性细胞率均显著降低(P＜0.000 1),肿瘤干细胞球皱缩,部分细胞死亡.小檗碱处理后的肿瘤干细胞,其最外层细胞膜肿胀,LDH释放率显著增加,且随剂量增大而升高(P＜0.05);小檗碱20、40 μmol/L组的GSDME-N、cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著上升,GSDME、caspase-3蛋白表达水平显著下降(小檗碱20 μmol/L组除外,P＜0.05).经小檗碱处理的斑马鱼胚胎发育几乎未受影响,胚胎存活率达到100%,未观察到明显畸形.结论 小檗碱具有较好的抗肿瘤干细胞增殖活性,其作用机制可能与激活GSDME、促进细胞焦亡有关;且小檗碱体内安全性良好.

目的:探讨对羟基苯甲酸乙酯(EtP)暴露对子一代(F1)斑马鱼胚胎发育毒性的影响及其相关分子机制.方法:将四月龄的雌性斑马鱼持续暴露于文献报道相关浓度 0.5 mg/L和 2mg/L中 28 d,染毒结束后,将已暴露EtP的雌性斑马鱼与同周龄的雄性斑马鱼交配,观察F1 代胚胎发育情况,采用转录组测序技术(RNA-seq),进一步阐释EtP暴露对F1 代毒性效应的分子机制.结果:与对照组比较,EtP组F1 代 96 hpf孵化率明显降低;死亡率和畸形率明显增加(P＜0.05),96 hpf卵黄囊面积和心率增加,24 hpf自发卷尾运动明显增加(P＜0.05);96 hpf眼面积明显减小(P＜0.05).EtP组F1 代 144 hpf幼鱼运动距离和游泳速度均明显降低(P＜0.05).F1 代 96 hpf幼鱼RNA-seq测序结果表明,DEGs与神经系统发育调节、眼睛的视网膜发育有关,且RT-qPCR与RNA-seq结果一致.结论:EtP母源性暴露可导致无EtP直接暴露的F1 代斑马鱼胚胎发育异常,特别是神经系统发育和视网膜发育.

目的 探讨亲代斑马鱼持续暴露于双酚 A(bisphenol A,BPA)及其类似物,对子代斑马鱼发育情况、行为学特征和生物钟基因表达水平的影响.方法 将 70 条 4 月龄雌性斑马鱼随机分为 7 组(对照组、BPA、BPS 和 BPF 浓度分别设定为0.1 以及 10.0 μg/L暴露组),连续染毒 28d后,收集鱼卵,分析计算其子代幼鱼的死亡率、孵化率和畸形率的变化;利用体视显微镜拍摄并测量受精后 72 小时(hour post fertilization,hpf)幼鱼的眼睛尺寸、眼间距、体长、心率和相对血流量以及 96 hpf活性氧水平;利用 Zebrabox斑马鱼行为追踪分析仪记录斑马鱼幼鱼行为学活动;qPCR 分析钟基因的表达水平.结果 BPA、BPS和 BPF暴露 28d后,与对照组相比,各染毒组的死亡率上升(P<0.05),孵化率、心率、相对血流量均降低(P<0.05),自发运动的振幅下降(P<0.05),活性氧含量及钟基因的表达水平都有所扰动.结论 亲代斑马鱼暴露于 BPA 及其类似物可能通过钟基因的改变导致子代斑马鱼的发育异常.

目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性.方法:设置 Cry1Ab 蛋白 7 个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3.通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50％inhibition concentration of growth and viability,IC50).设置Cry1Ab 蛋白 5 个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以 5-FU 为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies,EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50％inhibition concentration of differentiation,ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction,qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5 和 β-MHC)的 mRNA 表达情况.结果:5-FU 的 IC50,3T3为 46.37 μg/L,IC50,ES为 32.67 μg/L,ID50,ES为 21.28 μg/L,根据判别函数结果将 5-FU 分类为强胚胎毒性物质.不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P＞0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P＜0.05),且具有剂量依赖趋势(P＜0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P＜0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:本实验模型中未观察到31.25-2 000.00 μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性.

大脑是人体毒性效应最敏感的器官之一,化学物引起的神经毒性可造成神经系统的永久性损伤,然而大多化学物的神经毒性因缺乏高仿真的复杂模型而未得到充分评估.脑类器官是由人多能干细胞分化而来的3D细胞模型,包含了十余种神经细胞类型,能够模拟胚胎发育过程中人脑特有的结构和神经生理特性.相较于传统2D神经细胞和实验动物模型,脑类器官能够更好地模拟人类大脑特征,在化学物神经毒性评估方面具有独特优势.近年来,脑类器官模型被应用于药物、食源性物质、成瘾性物质、新污染物、有害金属、纳米材料等多种化学物的神经毒性研究,是评估化学物神经毒性及深入研究毒性机制的理想模型.本文系统总结了脑类器官模型在药物、有机化学物、无机化学物神经毒性方面的应用及研究进展,并探讨了目前脑类器官模型的局限性,展望了未来脑类器官模型在神经毒性研究中的前景.