目的:利用微团培养和胚胎干细胞试验评价二硝酰胺铵（ADN）潜在的胚胎发育毒性，并评估其是否为致畸物。方法:于2018年9月，分离大鼠胚胎并收集肢芽细胞，使用不同浓度（0、312.50、625.00、1 250.00、2 500.00、5 000.00、10 000.00 μg/ml）ADN进行染毒，计算细胞半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度并评价ADN致畸作用。在胚胎干细胞试验中，检测不同浓度（0、39.06、78.13、156.25、312.50、625.00、1 250.00、2 500.00 μg/ml）ADN对小鼠胚胎干细胞（mESCs）向心肌细胞分化的抑制作用，以及对mESCs和3T3细胞的细胞毒性，并评价其胚胎毒性。以已知的强胚胎毒性药物5-氟尿嘧啶和非胚胎毒性药物青霉素-G为试验材料，对模型的有效性进行验证，并采用验证性试验模型评价ADN的胚胎毒性。结果:微团培养试验中，各个浓度ADN组大鼠胚胎肢芽细胞增殖抑制率和分化抑制率均高于对照组（ P<0.05）；ADN对肢芽细胞的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为7 480.32和4 526.09 μg/ml，判定ADN为非致畸物。胚胎干细胞试验中，各个浓度ADN组mESCs增殖抑制率高于对照组，156.25、312.50、625.00、1 250.00、2 500.00 μg/ml ADN组3T3细胞增殖抑制率高于对照组（ P<0.05）。ADN对mESCs的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为1 851.73、1 796.39 μg/ml，对3T3细胞的半数增殖抑制浓度为3 334.35 μg/ml，判定ADN为无胚胎毒性。 结论:经微团培养和胚胎干细胞试验模型评价，ADN无胚胎毒性，属于非致畸物。

目的:分析细胞骨架结构改变对软骨细胞表型的影响.方法:二维及三维微团培养兔膝关节软骨细胞,分别破坏软骨细胞骨架的微管、肌动蛋白及波形蛋白,分析细胞骨架改变引起软骨细胞表型改变的关系.结果:破坏软骨细胞骨架的波形蛋白,可引起Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达下降,且三维微团培养较二维培养下降更明显,而Ⅰ型胶原蛋白表达则无明显改变:破坏软骨细胞骨架的微管,不引起Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达的改变;破坏软骨细胞骨架的肌动蛋白,在二维培养条件下可促进Ⅱ型胶原蛋白的表达,而在三维微团培养条件下,Ⅱ型胶原蛋白表达则无明显改变.结论:波形蛋白对维持正常软骨细胞表型起重要作用.

目的 探讨补肾活血方对小鼠肢芽细胞向软骨细胞分化增殖的影响.方法 分离12.5天小鼠胚胎肢芽细胞进行微团培养,同时用补肾活血方含药血清进行干预.采用MTT法检测肢芽细胞的增殖活性,阿尔新蓝染色检测肢芽细胞分化为软骨细胞能力,RT-PCR法检测肢芽细胞中Col2a1、Col10al、Mmp9、β-catenin、Runx2 mRNA的表达水平.结果 与空白对照组比较,补肾活血方含药血清组在24 h、48 h和72h3个时间点均能显著促进小鼠肢芽细胞增殖.微团培养6d后,阿尔新蓝染色结果显示补肾活血方含药血清组软骨细胞集落形成增加.RT-PCR结果显示补肾活血方含药血清组肢芽细胞Col2al mRNA表达水平增加,而Coll0al、Mmp9、β-catenin、Runx2 mRNA表达下调.结论 补肾活血方含药血清可能通过β-catenin信号通路促进小鼠胚胎肢芽细胞的增殖与分化.

目的 观察Zeste基因增强子同源物2(EZH2)选择性抑制剂GSK126对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响.方法 体外分离培养BMSCs,取第3代细胞进行实验.噻唑蓝(MTT)检测确定GSK126的最适浓度.将细胞消化、悬浮后,以5×106/ml的细胞密度进行高密度培养,用含有或不含GSK126的软骨诱导液诱导培养3周.免疫组织化学、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖的表达.实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖和性别决定区Y框蛋白9 (SOX9) mRNA的表达.Westem blot检测H3K27me3的蛋白含量.结果 5μmol/LGSK126无明显细胞毒作用,被选为本实验最适浓度.组织学染色显示实验组微团中的细胞体积较对照组稍大,细胞密度稍低.两组微团均有Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成与分泌,且实验组的表达最为强烈,实验组Ⅱ型胶原吸光度(A)值为0.3685±0.0405,对照组A值为0.1322±0.021 1.Real-timePCR检测显示,GSK126干预3周后实验组Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达量明显高于对照组(P＜0.01).Western blot检测显示对照组H3 K27me3蛋白水平显著高于实验组,GSK126的干预使得H3 K27 me3含量明显降低,实验组A值为0.3265 ±0.0302,对照组A值为0.6742±0.0562.结论 GSK126通过降低细胞内H3K27me3蛋白水平,有效地促进BMSCs成软骨方向分化.

目的:利用大鼠植入后全胚胎培养模型和微团培养模型评价硝酸镧潜在的胚胎早期和中、晚期发育毒性.方法:将大鼠胚胎随机分为5组后培养于含不同剂量硝酸镧(0、0.12、0.23、0.46及1 mmol/L)的即刻离心血清中,48 h后测量胚胎卵黄囊直径(YSD)、顶臀长(CRL)和头长(HL),计数体节,并根据Brown's评分法对胚胎进行总形态学评分(TMS).同时,对BALB/c 3T3细胞进行细胞毒性测试.根据欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的预测模型对硝酸镧的胚胎早期发育毒性进行评价.分离大鼠胚胎肢芽细胞,制成单细胞悬液,进行微团培养.分别用0.03、0.06、0.13、0.25、0.5、1、2及3 mmol/L硝酸镧进行染毒,利用中性红活细胞摄取染色法测定50％细胞增殖受抑制时的浓度(IC50)以反映细胞增殖情况,利用阿利新蓝染色法测定50％细胞分化受抑制时的浓度(ID50)以反映细胞分化情况.根据ECVAM预测模型对硝酸镧胚胎中晚期发育毒性进行评价.结果:硝酸镧对胚胎生长的无可见有害作用水平(NOAEL)为0.12 mmol/L,0.46 mmol/L硝酸镧可明显降低胚胎YSD、CRL和HL(P<0.05),对胚胎生长有明显的抑制效应.0.46 mmol/L硝酸镧可诱导胚胎产生发育畸形,减少胚胎体节形成数目(P<0.05).硝酸镧对肢芽细胞增殖活性的NOAEL为1 mmol/L,对肢芽细胞分化为软骨细胞的NOAEL为0.25 mmol/L,其IC50和ID50分别为1.57 mmol/L(510.25μg/mL)和0.99 mmol/L(321.75μg/mL).结论:经全胚胎培养预测模型评价硝酸镧为弱胚胎发育毒性化学物;经微团培养模型评价硝酸镧为无胚胎发育毒性化学物.

目的:利用大鼠植入后全胚胎培养模型和微团培养模型模拟胚胎发育早期和中、晚期过程,评价硝酸铈的发育毒性,以期为进一步开展体内实验研究及合理制定人群稀土接触的健康指导值提供科学依据.方法:取孕9.5 d的SD大鼠胚胎,分别在含0.00、0.50、0.75、1.00 mmol/L硝酸铈的大鼠即刻离心血清中37℃旋转培养,48 h后根据Brown's评分法对胚胎的生长发育及形态功能进行评分,结合BALB/c 3T3细胞毒性结果,利用欧洲替代方法验证中心(ECVAM)全胚胎预测模型评价硝酸铈胚胎早期发育毒性.分离孕13 d的SD大鼠胚胎肢芽原代细胞进行微团培养,分别用0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00和3.00 mmol/L硝酸铈进行染毒,培养5 d后利用中性红活细胞摄取染色法测定50％细胞增殖受抑制时的浓度(IC50),利用阿利新蓝染色法测定50％细胞分化受抑制时的浓度(ID50),根据ECVAM微团培养预测模型评价硝酸铈胚胎中、晚期发育毒性.结果:全胚胎培养模型中硝酸铈对胚胎生长的无可见有害作用水平(NOAEL)为0.50 mmol/L,0.75 mmol/L以上浓度硝酸铈可显著降低胚胎卵黄囊直径和顶臀长(P<0.05),抑制胚胎生长,并可致胚胎体节数目减少(P<0.05),胚胎发育畸形.微团培养模型中硝酸铈对肢芽细胞增殖活性的NOAEL为0.25 mmol/L,对肢芽细胞分化为软骨细胞的NOAEL为0.12 mmol/L,其IC50和ID50分别为1.23和0.76 mmol/L.结论:经全胚胎培养预测模型和微团培养模型评价硝酸铈为弱发育毒性化学物.

目的 通过体外培养大鼠中脑细胞微团和胚胎腭板,研究基因工程玉米Bt799及所表达Cry1 Ac蛋白发育毒性.方法 实验用大鼠选用Wistar大鼠,购自北京大学医学部实验动物部,年龄9周,体重(200±20)g,常规饲养于SPF级动物房.第一部分:于雌鼠孕13 d提取胚胎中脑细胞,以即刻离心血清替代培养基中胎牛血清,在不同条件下培养中脑细胞5 d,并观察其增殖分化情况.中脑细胞微团培养分八个组进行,分别对应八种不同培养环境.将制备ICS的Wistar大鼠随机分为六组,其中NM组、TM3组、TM1M组、TM3M组、PCB组为前五组大鼠,BP组、BC组、PCA组因大鼠未经直接干预且不影响组间比较,故共同使用第六组大鼠的血清.其中TM3、TM1 M、TM3M组使用经Bt799玉米干预3 d、1个月、3个月大鼠的血清,BP组使用添加Cry1Ac蛋白的血清,PCA使用添加双酚A的血清,PCB组使用经双酚A灌胃3 d大鼠的血清,NM组使用经亲本玉米郑58干预3 d大鼠的血清、BC组使用经AIN-93G饲料喂养3 d大鼠的血清.第二部分:于雌鼠孕12.5 d摘取大鼠胚胎腭板,以加入Cry1Ac蛋白(BP组)或全反式视黄酸(RA组)条件旋转培养腭板72 h,根据腭板融合情况计算融合率,判断Cry1 Ac蛋白对大鼠胚胎腭板发育的影响.结果 第一部分:TM3、TM1M、TM3M、BP组细胞增殖率、分化率与NM组、BC组相比差异均无统计学意义.PCA组和PCB组细胞增殖率和分化率低于NM组、BC组且差异有统计学意义.第二部分:BP组腭板融合率与BC组相比差异无统计学意义.RA组腭板融合率低于BC组,且差异有统计学意义.结论 本研究未观察到Bt799玉米及其表达蛋白Cry1 Ac的胚胎发育毒性.

目的 探讨温肾阳方及方中单味中药骨碎补、淫羊藿是否通过TGF-β信号通路促进小鼠肢芽干细胞增殖与分化.方法 分别采用温肾阳方(0.42 g生药/mL)、骨碎补(0.09 g生药/mL)及淫羊藿(0.09g生药/mL)煎剂和等体积生理盐水给大鼠灌胃,制备含药血清,分离孕12.5天小鼠肢芽干细胞进行微团培养,含药血清干预后,CCK-8法检测肢芽干细胞增殖能力,阿尔新蓝染色检测软骨分化能力,IPP软件统计软骨球个数及面积,Real-time PCR法检测Col2a1及Aggrecan表达水平.采用293T细胞,脂质体转染TGF-β信号通路报告基因4xSBE,荧光素酶实验分析各组对TGF-β信号通路的调节作用.采用TGF-β信号通路抑制剂SB431542抑制肢芽干细胞中TGF-β信号通路,进行阿尔新蓝染色及软骨细胞外基质检测.结果 与空白组比较,温肾阳方、淫羊藿、骨碎补组干预48 h和72 h后小鼠肢芽干细胞增殖均增强(P＜0.01,P＜0.05).阿尔新蓝染色显示,温肾阳方、淫羊藿、骨碎补组软骨球个数及面积增加(P＜0.05),软骨细胞基质Col2a1及Aggrecan的表达增强(P＜0.01).荧光素酶实验发现,与空白组比较,各中药组TGF-β信号通路活性上调(P＜0.01,P＜0.05).加入TGF-β信号通路抑制剂SB431542后,与空白组比较,抑制剂组软骨球个数及面积均明显减少(P＜0.01);而温肾阳方、淫羊藿、骨碎补组软骨生成抑制显著缓解(P＜0.05),但与空白组比较,软骨球个数及面积仍明显减少(P＜0.01,P＜0.05),Col2a1及Aggrecan水平也有相似的变化趋势(P＜0.01).结论 温肾阳方及温肾阳药骨碎补、淫羊藿可以部分通过TGF-β信号通路促进小鼠肢芽干细胞增殖与分化.

目的:研究槟榔碱在体外培养下对大鼠胚胎软骨发育的影响,从而探究槟榔碱的胚胎致畸性.方法:取受孕d 14大鼠胚胎肢芽,前肢芽利用微团培养技术进行体外培养,根据半数细胞增殖抑制浓度(IC50-P)和半数细胞分化抑制浓度(IC50-D)及其比值判定受试物的致畸性;利用离体器官技术培养后肢芽,随机分为空白对照(0 mg·mL-1槟榔碱)、低剂量(0.1 mg·mL-1槟榔碱)、中剂量(1 mg·mL-1槟榔碱)、高剂量(10 mg·mL-1槟榔碱)、阳性对照(100 ng·mL-15-氟尿嘧啶)5个实验组,分别在体外培养24,72和120 h后收获,在体视镜下进行形态学评分后,石蜡包埋、切片、HE染色和甲苯胺蓝染色观察细胞和软骨形态,并通过免疫组化技术研究槟榔碱对在各组软骨细胞骨形态发生蛋白2(BMP-2)表达的影响.结果:在微团模型中根据欧洲替代方法验证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods,ECVAM)预测模型判定槟榔碱为胚胎中晚期发育毒性化学物,为非特异性弱致畸物;在整体肢芽器官模型中,1 mg·mL-1(中剂量)及以上浓度的槟榔碱会对肢芽器官造成发育毒性,10 mg·mL-1(高剂量)从给药24 h后便能产生显著毒性,各剂量组在72 h培养后发育状况出现了显著的剂量相关性;从病理切片结果可以看出,槟榔碱会进一步影响增殖软骨细胞和肥大软骨细胞的增殖分化,从而影响肢芽指掌与肢臂的发育;在BMP-2表达的免疫组化结果中,BMP-2的表达强度呈现与槟榔碱剂量相关性,槟榔碱的剂量越大,阳性表达程度越低,反映软骨细胞增殖分化放缓.结论:大于1 mg·mL-1的槟榔碱在大鼠胚胎肢芽体外培养中有生长抑制作用,可初步认为槟榔碱对胚胎中后期发育具有弱致畸性,可能是通过影响BMP-2的表达来抑制软骨细胞的增殖分化.