目的:探讨趋化因子配体5(CCL5)及受体在脑胶质瘤微环境中的表达，及其介导脑胶质瘤相关间充质干细胞(gaMSCs)促肿瘤细胞的增殖和侵袭机制。方法:提取并培养gbMSCs(取自15例2017年1月至10月华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科手术切除人脑胶质瘤新鲜肿瘤组织标本，WHO Ⅳ)。使用实时荧光定量聚合酶链反应法(qPCR)检测U87、gbMSCs、BM-MSC和4例外伤脑组织中CCL5表达。使用蛋白质印迹法(Western blot)法、qPCR和免疫细胞染色检测脑胶质瘤细胞株U87和GBM细胞中CCL5受体CCR1、CCR3、CCR5的表达。使用细胞计数法、细胞增殖/毒性检测试剂盒-8(CCK-8)实验、磺酰罗丹明B比色(SRB)法和3D肿瘤球体细胞侵袭实验检测gaMSCs对U87和GBM的增殖和侵袭作用。使用细胞计数法、磺酰罗丹明B比色(SRB)法和3D肿瘤球体细胞侵袭实验检测使用不同浓度CCL5及其抗体对gaMSCs促脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的具体机制。多组的比较采用单因素方差分析，进一步实验组或对照组两两比较采用LSD- t检验，Western blot实验结果采用 t检验。 结果:gaMSCs可促进脑胶质瘤细胞增殖和侵袭，CCK-8法检测gaMSC1，gaMSC2组及Control组培养胶质瘤细胞U87增殖能力，细胞活性为1.320±0.063、1.250±0.087和0.700±0.012( F＝42.270， P<0.05)。3D肿瘤球体细胞侵袭实验检测U87在Control、gaMSCs1、gaMSCs2组的细胞侵袭性定量分别为10.23±0.64、29.25±0.87和24.79±0.92( F＝37.610， P<0.05)。gaMSCs和骨髓间充质干细胞(BMSCs)一样高表达CCL5，qPCR检测CCL5 mRNA在BMSCs和gaMSCs1、gaMSCs2、gaMSCs3中的表达，分别为0.62±0.05、0.61±0.03、0.62±0.04、0.59±0.07( F＝5.290， P>0.05)。进一步比较GBM中和Control外伤脑组织的CCL5 mRNA表达，分别为0.55±0.03、0.22±0.05，两两比较，差异有统计学意义( F＝34.750， P<0.05)。脑胶质瘤组织中持续表达CCR3 (14/15的阳性表达)，部分表达CCR5(11/15的阳性表达)，而CCR1几乎不表达(0/15的阳性表达)，差异有统计学意义( F＝86.010， P<0.05)。CCL5 Ab可以明显抑制gaMSCs条件培养液促胶质瘤细胞的增殖和侵袭的能力，不同浓度CCL5(20 μg/L和50 μg/L)均能促U87更快的增殖和侵袭。SRB实验：U87细胞的Control组、gaMSCs组和gaMSCs＋CCL5 Ab(20 μg/L)组细胞存活率分别为0.480±0.030、0.831±0.010和0.571±0.160，比较与对照组，CCL5Ab(20 μg/L)明显抑制gaMSCs条件培养液促U87细胞的增殖，差异有统计学意义( F＝57.930， P<0.05)。含0、25、50 μg/L CCL5的无血清培养液，培养U87细胞4 d后，平均细胞计数分别为18.1×10 4个/孔、21.9×10 4个/孔、26.6×10 4个/孔，细胞增殖数依次增高( F＝42.830， P<0.05)。3D肿瘤球体细胞侵袭实验：U87细胞球在Control、gaMSCs、gaMSCs＋CCL5 Ab(25 μg/L)培养液，细胞侵袭性定量分别为10.53±0.04、26.78±0.61和11.37±0.23，差异有统计学意义( F＝54.270， P<0.05)。gaMSCs条件培养液中加入CCL5 Ab(25 μg/L)明显抑制gaMSCs条件培养液促U87细胞侵袭能力；U87细胞球在含0、10、20 μg/L CCL5的无血清培养液中，细胞侵袭性定量分别为9.97±0.82、15.25±0.43和24.52±0.21，细胞球侵袭面积依次增大，两两比较，差异有统计学意义( F＝74.360， P<0.05)。 结论:脑胶质瘤相关间充质干细胞促进脑胶质瘤增殖和侵袭，CCL5在该过程起关键作用。

下颌骨的发育来源及发育过程均与全身其他骨骼有着显著差异,其发育异常会导致各种骨相关疾病,严重影响了患者的生活质量.近年来Hedgehog信号通路在骨骼发育过程中的作用越来越受到关注.Hedgehog基因包括Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)3种亚型,其中Shh及Ihh可通过多种途径参与骨代谢调节,Shh主要参与肢体发育过程,而Ihh主要是在软骨内成骨过程中发挥关键作用.Hedgehog信号通路包括Hedgehog信号蛋白配体、Patched(Ptch)受体、Smoothed(Smo)受体、核内转录因子神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homologue,Gli)和下游靶基因等.典型Hedgehog信号通路由Gli激活调控,而非典型Hedgehog信号主要由Ptch、Smo等调控.Shh在早期脊椎动物胚胎形成过程中调控多种生物学行为,如器官的分化、神经干的形成、干细胞的分化增殖、四肢骨骼发育以及牙胚发育等;在骨细胞分化过程中,Shh、Ptch1和Gli1在成骨细胞中均有表达,进一步促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞和软骨细胞分化.Ihh对骨骼生长发育以及稳态维持具有不可或缺的功能作用,参与膜内骨领的形成、软骨细胞的增殖和成熟,Ihh在成熟的颅骨成骨细胞中表达,其可作为促成骨因子调控Ptch和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)的表达来诱导膜内骨化过程;脑和肌肉ARNT样蛋白1(brain and muscle ARNT-like 1,BMAL1)可通过与Ptch1和Ihh结合,调节Hedgehog信号通路,在颞下颌关节的软骨形成和软骨内成骨过程中发挥关键作用;而Hedgehog信号激活剂可以改善由BMAL1缺失引起的下颌骨骨量减少.Hedge-hog信号失调会对骨发育过程产生重大影响,并导致一系列骨疾病如骨发育异常、骨折、骨质疏松和骨关节炎.然而,Hedgehog信号通路与下颌骨疾病的相关作用机制尚未完全阐明,未来研究可进一步探讨Hedgehog信号作为治疗下颌骨发育相关疾病的潜在靶点.

目的 探讨微原纤维相关蛋白 3(microfibril-associated protein 3,MFAP3)在胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)中的表达与临床意义,以及对于胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)恶性生物学行为的影响.方法 利用TCGA 数据和 CGGA 数据分析 GBM 中 MFAP3 表达情况及其与患者预后相关性;使用 Western blotting检测胶质瘤干细胞系中MFAP3 蛋白表达水平;探究敲减及过表达MFAP3 对胶质瘤干细胞自我更新能力和表型的影响.结果 MFAP3 在GBM中高表达,且与患者不良预后相关.间充质型GSCs中MFAP3 的表达水平高于前神经元型GSCs.MFAP3 敲减后,GSCs自我更新能力减弱,间充质表型标志物CD44、YKL40 蛋白水平均降低,过表达与之相反.结论 MFAP3 对GBM恶性生物学进展具有重要调控作用,有望成为新的GBM临床诊断标志物和治疗干预靶点.

目的:探讨人脐带间充质干细胞外分泌上清(hUMSC-CM)联合替莫唑胺(TMZ)在不同胶质瘤细胞系中的协同增敏作用及潜在机制.方法:采用2种血清剥夺法(24和48 h分批次撤血清法)收集hUMSC-CM并制备成冻干粉,设置5种浓度(0、1、3、6和9 g/L)处理大鼠恶性胶质瘤细胞系RG-2、人星形细胞瘤细胞系U251和人胶质母细胞瘤细胞系LN-428.通过CCK-8实验检测hUMSC-CM作用于胶质瘤细胞24、48和72 h后的肿瘤抑制可行性及敏感度.HE染色结合CCK-8法确定6种浓度(0、25、50、100、200和400 μmol/L)的TMZ作用于胶质瘤细胞48 h后化疗敏感性的差异.筛选出低、高2种浓度(3和9 g/L)的hUMSC-CM和低、中、高3种浓度(50、100和200 μmol/L)的TMZ配伍,作用于胶质瘤细胞后检测细胞活力和病理形态学变化.TUNEL染色检测细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期变化;Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved PARP1,以及自噬相关蛋白beclin-1和LC3的表达变化,探讨hUMSC-CM与TMZ体外联合给药协同增敏的作用机制.结果:3种胶质瘤细胞系对hUMSC-CM和TMZ的敏感度为RG-2＞U251＞LN-428.hUMSC-CM(3和9 g/L)与TMZ(50、100和200 μmol/L)配伍给药对胶质瘤细胞生长的抑制作用比单独给药组显著增强(P＜0.05),且随着配伍药物剂量的增加而增强.其中,9 g/L hUMSC-CM(C9)与50 μmol/L TMZ(T50)配伍可有效抑制胶质瘤细胞生长.与C9或T50组相比,CCK-8实验显示C9+T50组细胞活力显著下降(P＜0.05),HE染色和TUNEL检测结果显示C9+T50组细胞形态变化明显,出现典型凋亡形态学特征,流式细胞术结果显示C9+T50可诱导胶质瘤细胞周期发生阻滞,Western blot结果显示C9+ T50组细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved PARP1、beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著升高(P＜0.01).结论:(1)hUMSC-CM与TMZ配伍给药对胶质瘤细胞的抑制作用具有广谱性,且两者之间存在增敏作用,在不同细胞系中呈现不同的增敏效果.(2)hUMSC-CM提高胶质瘤细胞对TMZ敏感度的机制可能与调节caspase-8/caspase-3/PARP1信号通路及自噬通路、诱导胶质瘤细胞发生凋亡和自噬有关.

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)主要通过调控编码蛋白基因的表达、染色质重构、组蛋白修饰,以及作为小分子RNA的前体分子,在人类癌症中广泛扩增.lncRNA已被证实能在多种肿瘤细胞中过表达.在胶质瘤中,lncRNA的表达量与胶质瘤的分级密切相关,参与调控胶质瘤细胞的增殖、肿瘤新生血管形成,并对胶质瘤细胞的上皮间充质转化(EMT)进行调节,促进胶质瘤干细胞的存活,可能与胶质瘤的异质性存在相关性.本文对lncRNA在胶质瘤发生发展中的研究进展进行综述,探讨lncRNA对胶质瘤的增殖与侵袭、信号传导通路和分子靶向治疗的重要意义.

目的 探讨七氟烷对人脑胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响及相关机制.方法 接种对数生长期的人脑胶质瘤细胞 U251于培养皿中,细胞传代后分为对照组及七氟烷组.对照组通入含5%CO2及95%的空气,七氟烷组通入5%CO2及92.5%的空气和2.5%七氟烷,气流量为2 L/min,处理4 h.Transwell侵袭实验检测两组细胞侵袭能力的变化,细胞划痕修复实验检测细胞迁移能力,Western印迹检测两组细胞上皮间充质转化(EMT)相关分子〔包括E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、snail及紧密连接蛋白(Zo)-1〕、肿瘤干细胞相关分子(包括 CD133)及侵袭相关分子〔包括基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9〕表达的变化.结果 七氟烷组穿透基底膜细胞数显著低于对照组(P<0.05).七氟烷组细胞24 h后划痕修复面积差显著低于对照组(P<0.05).七氟烷组相比对照组细胞E-cadherin及Zo-1表达显著上调,N-cadherin、snail、CD133、MMP-2及 MMP-9表达显著下调(P<0.01).结论 七氟烷可显著抑制人脑胶质瘤细胞的侵袭迁移能力,相关机制可能与其对细胞干性、EMT及MMP的抑制作用有关.

背景:脐带间充质干细胞是一类具有自我更新能力、高度增殖能力和多向分化潜能的细胞.脐带间充质干细胞的特性尤其是肿瘤嗜性能力使其成为神经胶质瘤细胞治疗的理想工具.这些细胞可以通过旁分泌或者作为基因和药物的递送系统起作用.已经证明脐带间充质干细胞能够抑制脑胶质瘤的生长并改善移植入大脑后的存活.目的:总结脐带间充质干细胞在脑胶质瘤治疗中分子机制和安全性的研究和进展,并为其进一步研究提供有益的参考.方法:应用计算机检索2000至2017年 PubMed 和 CNKI 数据库相关文章,英文检索词为"Glioma;Umbilical cord mesenchymal stem cells",中文检索词为"胶质瘤;脐带间充质干细胞;安全性;分子机制".根据纳入与排除标准,最终保留55篇文献进行综述.结果与结论:①脐带间充质干细胞治疗脑胶质瘤有着明显的作用;②脐带间充质干细胞可以通过其归巢特征、旁分泌机制、作为基因载体和共培养对脑胶质瘤进行治疗;③脐带间充质干细胞在脑胶质瘤的治疗中具有一定的安全性.

目的 探讨胶质瘤干细胞(GSC)诱导TME中多种间质细胞的恶性转化及其相关分子特征.方法 将红色荧光蛋白(RFP)基因稳定转染人SU3-RFP的GSC与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因裸小鼠间质细胞体外共培养,将SU3-RFP细胞接种于EFGP-Balb/c裸小鼠不同部位,从体外培养基与体内肿瘤组织中分别单克隆具永生化特征的EGFP+细胞,经染色体分析和致瘤试验证实其具有肿瘤细胞特征,再以RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫化学染色等分子手段检测相关分子表型.结果 (1)体外培养共得到2株EGFP+细胞系,体内致瘤实验共得到5株EGFP+细胞系,所克隆的7株EGFP+细胞具自我更新、呈异倍体染色体核型和100％致瘤率;(2)根据细胞标志物表达状况鉴定其分别起源于巨噬细胞(tMΦ1和tMφ2)、树突状细胞(tDC1和tDC2)、成纤维细胞(tFB)、少突胶质细胞(tOG)和骨髓间充质干细胞(tBMSC);(3)根据七株细胞共同表达Sca-1(髓源性干细胞标志物)和c-myc,分别表达Sox2、Nanog等诱导性多能干细胞(iPS)标志物,确定这些恶性转化细胞不同程度上兼具髓源干细胞和iPS细胞的分子特征.结论 (1)TME中肿瘤间质细胞自身恶变与GSC对TME组织重构相关,与其寄生地组织类型关系不大;(2)源于GSC的肿瘤细胞和GSC TME中恶变的间质细胞,是GSC重构的肿瘤组织内两大类不同起源的肿瘤细胞,由此构成广义肿瘤异质性概念的细胞学基础,后者有潜力作为靶向诊疗的新靶标.

目的 探讨C6脑胶质瘤细胞微环境中肿瘤坏死因子α(TNF-α)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性的影响.方法 将BMSCs与C6脑胶质瘤细胞非接触间接共培养7d,将细胞分为BMSCs组、共培养组、共培养+0.5ng/mlTNF-α组及共培养+5ng/ml TNF-α组(在共培养基础上分别加入0.5ng/ml TNF-α及5ng/ml TNF-α).ELISA分别检测BMSCs、共培养细胞上清中游离TNF-α蛋白的表达情况.采用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化;采用CCK8法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell检测细胞迁移能力;采用Real-time PCR检测细胞中c-Myc、CyclinDl mRNA的表达,Western blotting检测细胞中NF-κB/P65、c-Myc、CyclinDl蛋白的表达.结果 共培养细胞上清中游离TNF-α表达水平[(162.45±31.82)pg/ml]明显低于BMSCs细胞上清[(467.90±150.98)pg/ml](P＜0.05).BMSCs组细胞排列整齐,成纤维状生长,共培养+5ng/ml TNF-α组与BMSCs形态较一致,但凋亡细胞增多,而共培养组及共培养+0.5ng/ml TNF-α组细胞形态显著改变.共培养组细胞增殖能力、G2+S期细胞所占比例以及迁移能力均高于BMSCs组(P＜0.05),且CyclinDl、c-Myc mRNA及蛋白水平表达也高于BMSCs组(P＜0.05),而共培养+5ng/ml TNF-α组细胞增殖能力、G2+S期细胞所占比例以及迁移能力均明显低于共培养组、共培养+0.5ng/ml TNF-α组(P＜0.05),CyclinD1、c-MycmRNA及蛋白水平表达明显低于共培养组、共培养+0.5ng/ml TNF-α组(P＜0.05).结论 C6脑胶质瘤微环境使BMSCs产生肿瘤相关生物学特性的改变,且共培养后TNF-α表达降低可能是引发其生物学特性改变的重要因素,加入高浓度的TNF-α对于维持干细胞本身生物学特性的稳定性有重要意义.

目的 探讨脐带血衍生间质干细胞(UCB-MSCs)体外抑制C6胶质瘤细胞增殖、诱导凋亡的机制.方法 采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测C6细胞半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-8、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和Caspase-3 mRNA水平,膜联蛋白V(Annexin V)-碘化丙锭(PI)双染法检测细胞凋亡.结果 混合UCB-MSCs在转录水平上有使Caspase-8、bax、Caspase-3 mRNA表达增高的趋势,bcl-2 mRNA表达降低的趋势.促凋亡蛋白表达量和凋亡细胞数随E/T(E:效应细胞即UCB-MSCs,T:靶细胞即C6细胞)的比例增高而增高,呈现比例依赖关系;E∶T=(5+5)∶1,RT-PCR检测C6细胞Caspase-8、bax、bcl-2和Caspase-3 mRNA相对表达量分别为0.78±0.13、0.28±0.03、0.70±0.08、0.76±0.12.当E/T =0∶1、5∶1、(2.5+2.5)∶1、10∶1、(5+5)∶1时,Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)和PI双染色检测凋亡C6细胞数量分别为(2.9±0.6)、(3.1±0.5)、(14.5±1.8)、(14.3±2.2)、(22.8±4.5)个.结论 经植物凝集素(PHA)刺激后,大剂量UCB-MSCs和混合UCB-MSCs都对体外C6细胞具有抑制增殖作用,而且这种抑制作用可能与诱导凋亡明显相关.