[目的]乳酸链球菌素(nisin)是一种天然生物活性抗菌肽,对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用,而用作食品的防腐剂.本研究通过建立高通量筛选方法,实现高效快速省力的高产菌株筛选,为工业上筛选高产菌株提供研究方案.[方法]通过对Lactococcus lactis ATCC11454菌株进行紫外诱变,获得2511株突变株.利用Biomek FXP自动工作站建立96微孔板的高通量筛选方法,突变株经高通量挑选、菌种培养及菌液稀释后,加入到生长至对数中期的藤黄微球菌中,采用改进后的比浊法快速检测nisin生物活性.用此方法对突变株进行初筛、复筛后可得到nisin高产菌株,并通过摇瓶发酵评估高通量筛选方法.[结果]确定比浊法检测的条件为:nisin活性稀释在10-25 IU/mL范围内,与藤黄微球菌反应2h后检测藤黄微球菌的菌体量(OD600).2511株突变株经过2轮高通量筛选,最终获得约50株产量提升的菌株,对其中8株进行摇瓶精确测量,显示产量均有提高,并且其中一株产量提升了30％,成功建立了高通量筛选nisin高产菌株的方法.[结论]利用比浊检测法,在其基础上成功建立高通量筛选高产nisin菌的方法,经过初筛复筛,整个周期由1人耗时5d即可完成2511株突变株的筛选工作.相较于传统的选育方法,高通量筛选具有快速、稳定、高效的特点,提高了筛选效率,缩短了选育周期,是工业上筛选高产nisin菌的有效手段.

[目的]波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)是冷藏海产鱼类的特定腐败菌.研究群体感应信号AI-2/LuxS对鱼源S.baltica生物被膜和致腐的调控作用.[方法]扩增SBll分离株的luxS基因,用自杀性质粒构建luxS基因缺失株,通过结晶紫染色、珠涡流法、显微镜观察和HPLC,比较分析野生株与缺失株△luxS在4℃和28℃下生物被膜形成、粘附能力、泳动性和致腐产物的差异.[结果]S.baltica SB11中扩增获得luxS基因,生物信息学分析显示LuxS蛋白由169个氨基酸构成,含有保守的His-Thr-Leu-Glu-His (HTLEH)模体和关键氨基酸位点,蛋白三维空间结构与其他细菌相似.与野生株相比,△luxS缺失株上清荧光信号散失,但不影响生长,生物被膜形成期和成熟期的含量显著低于野生株,在4℃培养96 h和28℃培养24 h被膜分别减少20.1％和27.9％.缺失株在不锈钢片的粘附能力明显减弱,其中在4℃培养72 h和28℃培养24 h后的粘附量比野生株分别减少6.48％和6.57％.荧光显微镜观察发现,野生株能快速粘附于玻璃片,聚集形成大量生物被膜,而△luxS仅形成平坦稀疏的被膜,粘附细菌降低,CLSM证实野生株和△luxS的成熟被膜厚度分别为68.95 μm和36.44 μm.并且,△luxS株在4℃和28℃下泳动性均显著强于野生株.然而,野生株和△luxS株三甲胺和腐胺积累无差异.[结论]鱼源S.baltica中LuxS蛋白保守,AI-2/LuxS参与被膜、粘附能力及泳动性等多种生物被膜形成相关的调控作用,然而不是该菌致腐能力的功能性群体感应信号.

目的 探讨哌拉西林对肺部感染新生儿治疗疗效及对肠道益生菌菌落平衡影响.方法 选取2015年1月-2017年5月于医院接受治疗的300例肺部感染新生儿为研究对象,按照随机数字表法将新生儿分为哌拉西林组、头孢类组和联合用药组,同时选取同期医院健康新生儿作为健康组,每组各100例.其中哌拉西林组使用哌拉西林抗菌药物进行治疗,头孢类组使用头孢类抗菌药物进行治疗,联合用药组使用哌拉西林联合头孢类抗菌药物进行治疗.收集四组研究对象粪便进行细菌培养并进行肠道菌落类型及数量检测,统计三组患儿不良反应发生情况,分析评价三组患儿临床疗效.结果 哌拉西林组、头孢类组、联合用药组益生菌中的乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌数量较健康组低(P均<00.5),腐败菌中的肠杆菌、肠球菌数量高于健康组(P<00.5);哌拉西林组显效例数57例占57.00％ 、有效例数36例占36.00％,头孢类组显效例数55例占55.00％ 、有效例数33例占330.0％,联合用药组显效例数60例占600.0％ 、有效例数37例占370.0％,三组患儿疗效均处于较高水平,组间比较差异无统计学意义.结论 哌拉西林治疗新生儿肺部感染疗效与其他抗菌药物疗效相似,但能够有效改善患儿肠道菌落益生菌失调状况,联合用药疗效较好,但不良反应发生情况较多,同时容易导致患儿肠道益生菌失衡.

动态研究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LP)和布氏乳杆菌(Lactoacillus buchneri,LB)对干玉米秸秆与白菜废弃物连续混贮170 d期间品质变化的影响,利用MiSeq高通量测序平台考察细菌多样性.无添加剂设为对照组(ME组),定期分析感官品质、有机化学组分、发酵品质和细菌多样性,结果表明,与ME组相比,30 d时LB和LP组干物质(DM)含量均显著(P＜0.05)下降,之后分别于60 d和90 d显著(P＜0.05)增加,且LB组始终高于LP组.贮存170 d期间LP和LB组中可溶性碳水化合物(wsC)含量显著(P＜0.05)高于ME组,且LB组始终高于LP组(除130 d).30-90 d期间LP和LB组pH显著(P＜0.05)低于ME组,且LP组始终低于LB组,LP组乳酸(LA)含量显著(P＜0.05)增加,氨态氮/总氮(AN/TN)显著(P＜0.05)降低.130-170 d期间LP和LB组中乳酸/乙酸(LA/AA)和乳酸/总有机酸(LA/TOA)均明显低于ME组,乳酸发酵程度变弱.3个处理组中厚壁菌(Firmicutes)和变形菌(Proteobacteria)为门水平优势类群;乳杆菌(Lactobacillus)始终为属水平优势菌;2种乳酸菌剂均能使肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)和黄杆菌(Flavobacterium)等腐败菌丰度显著(P＜0.05)降低,130 d时Enterobacter消失.总之,L.plantarum有助于改善混贮中前期(90 d)发酵品质,能有效保存纤维素、半纤维素和综纤维素等能源组分,L.buchneri有利于170 d贮存期间的DM和WSC保存;建议实际生产中根据贮存周期长短来选择适宜的乳酸菌,以便获得最佳贮存品质.

[目的]微生物活动是引起食品腐败的主要原因, 研究食品腐败菌的腐败作用调控机制对于保证食品的质量和安全具有重要意义.荧光假单胞菌是一种代表性的食品腐败菌, 本文旨在研究RNA聚合酶的选择性sigma因子Rpo S在荧光假单胞菌致腐败过程中的作用.[方法]运用同源重组的方法构建荧光假单胞菌冷藏鱼分离株的rpo S基因缺失突变株, 比较野生型和突变株暴露于不同胁迫条件下的存活率;通过液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析野生型和突变株产生高丝氨酸内酯类 (AHLs) 群体感应信号分子的种类和含量;检测野生型和突变株接种于灭菌三文鱼汁后4°C贮存过程中的菌落总数和挥发性盐基氮的生成量.[结果]成功构建了荧光假单胞菌rpo S基因缺失突变株.rpo S基因的缺失导致荧光假单胞菌对10 mmol/L H2O2和15％乙醇的耐受性显著降低, 对150μg/m L结晶紫和175 mmol/L醋酸的耐受性有一定程度增强, 不影响其对47°C和20％Na Cl的耐受性.荧光假单胞菌在rpo S基因缺失突变后长链信号分子C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL的含量增加.在灭菌三文鱼汁中的腐败活性检测表明rpo S基因缺失可导致荧光假单胞菌挥发性盐基氮的生成量显著降低.[结论]荧光假单胞菌的Rpo S不仅调节细菌对多种胁迫条件的耐受性, 还影响AHL群体感应和腐败活性.

为促进干秸秆的跨季节贮存及尾菜资源化利用,利用青贮原理将干玉米秸秆与白菜废弃物进行混合贮存发酵,探讨不同添加量乙酸对二者混贮发酵品质的影响,并通过Miseq高通量测序技术解析发酵过程中的微生物多样性.设置ME组(无乙酸添加)为对照组,AA组(添加量0.3％)和AB组(添加量0.6％)为2个乙酸处理组,18±1℃恒温密闭混贮60 d,间隔30 d分析其化学组分、发酵品质及微生物多样性.结果表明,AA组贮存60 d时的干物质、可溶性碳水化合物和粗蛋白含量均显著高于ME组,酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量显著下降,半纤维素、纤维素和综纤维素含量显著增加.AB组在30 d和60 d时pH均显著低于ME组,乳酸含量在30 d时显著增加,60 d时显著降低.AA组和AB组中乳酸/乙酸、乳酸/总有机酸及氨氮/总氮值均低于ME组.混贮发酵期间ME组、AA组和AB组的门水平细菌主要为Proteobacteria和Firmicutes,属水平细菌包括Lactobacillus、Paralactobacillus、Enterobacter、Pediococcus、Flavobacterium、Chryseobacterium、Pedobacter、Sphingomonadaceae、Erwinia等,其中Lactobacillus、Paralactobacillus和Enterobacter为优势菌.与ME组相比,AA组和AB组中腐败菌Enterobacter丰度呈下降趋势;2个乙酸处理组的总乳酸菌丰度高于ME组,但乳酸菌多样性较ME组有所减少,主要包括Lactobacillus、Paralactobacillus和Pediococcus等乳酸菌属.总之,干玉米秸秆与白菜废弃物能以适宜比例混贮60 d不变质,尽管添加乙酸后的乳酸发酵强度有所抑制,但低剂量乙酸更有助于保存干物质、可溶性碳水化合物、粗蛋白、综纤维素等有机组分,建议乙酸添加量为0.3％.

群体感应(quorum sensing,QS)是一种微生物细胞间进行信息交流的系统.腐败菌的一些特性也受到QS系统的调控.在水产品保鲜领域,腐败菌的群体感应逐渐成为研究热点.本文中,笔者着重对水产品中微生物的群体感应作用机制、主要腐败菌的群体感应现象以及群体感应抑制剂等方面的研究进展进行概述,并对目前群体感应研究中所出现的问题及发展进行了总结及展望,旨在为以群体感应为基础的新型食品保鲜材料的开发提供参考.

气单胞菌是冷藏凡纳滨对虾的重要腐败菌,为更好地控制气单胞菌引起的腐败变质,笔者分析了气单胞菌的群体感应特性.结果表明,在腐败的凡纳滨对虾中成功分离出了气单胞菌Aeromonas sp.A01,经16S rRNA鉴定,该菌与气单胞菌属Aeromonas sp.J1.3E2的同源性达99.0％.Aeromonas sp.A01可分泌酰化高丝氨酸内酯类信号分子C4 HSL,且体外培养12 h可达最高值.外源信号分子C4 HSL可促进Aeromonas sp.A01对数期后期的生长,且显著提升蛋白酶分泌能力与生物膜形成能力.相比于对照,10μmol/L的C4 HSL分别将Aeromonas sp.A01的蛋白酶活力和生物膜形成量提高了20％和51％.表明气单胞菌的生长、蛋白酶分泌和生物膜形成均与AHLs介导的群体感应密切相关,气单胞菌的群体感应系统可作为控制凡纳滨对虾腐败的新靶点.

假单胞菌属细菌中的部分菌株是动植物和人类的致病菌,也是食品的腐败菌,会导致动植物和人类的高死亡率和严重的食品安全事故.噬菌体作为一种细菌性病毒,特异性高、自我增殖快且无副作用.这些特性使其成为了解决细菌性问题的新思路和新方法.本文就利用噬菌体防控假单胞菌属致病菌和腐败菌在食品、水产、植物、医疗等方面的研究和应用进行综述,以便为后期的深入研究提供一定的参考.

为提升干玉米秸秆与废弃白菜的混贮品质,研究接种异常毕赤酵母(Pichia anomala)对干玉米秸秆与废弃白菜混贮发酵品质的动态影响.试验设置无添加剂对照组(ME)和微生物处理组(PA),连续恒温贮存发酵170 d,间隔一定时间分析感官质量、有机组分和发酵品质,并利用高通量测序技术考察发酵过程中细菌群落的动态变化.结果显示:与ME组相比,贮存170 d期间PA组中的干物质、粗蛋白、可溶性碳水化合物和乳酸含量显著增加(P＜0.05),pH值、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著降低(P＜0.05),乳酸/乙酸和乳酸/总有机酸比值得到优化.细菌群落结构显示:PA组中门水平优势菌为厚壁菌(Firmicutes)和变形菌(Proteobacteria),属水平优势菌为乳杆菌(Lactobacillus)和类乳杆菌(Paralactobacillu).接种异常毕赤酵母能使肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)和黄杆菌(Flavobacterium)等腐败菌的相对丰度逐步降低,130 d时肠杆菌消失,有益乳酸菌的总丰度始终保持在50％以上.本研究表明接种异常毕赤酵母能改善干玉米秸秆与白菜的混贮发酵品质,使干秸秆能保质贮存近半年时间,结果可为其资源化利用提供原料保障.