生物膜是牙龈卟啉单胞菌（Pg）保持生命力的基础，基因表达的差异影响了Pg生物膜的形成，在众多感应系统中种间群体感应系统（LuxS/AI-2 QS系统）更有利于Pg进行信息交流和摄取血红素及铁从而形成生物膜，本文就此作一综述。

目的:探讨长期使用氯己定对粪肠球菌(E.faecalis)耐药性的影响,并阐明其作用机制.方法:将E.faecalis标准菌株反复暴露于氯己定中传代10代,记录每一次传代时的最低抑菌浓度(MIC)值.收集第10代且MIC值增加的细菌,即为E.faecalis氯己定耐药菌株(E.faecalis-Cs).绘制2种菌株生长曲线,透射电子显微镜观察2种菌株形态表现,结晶紫染色法检测2种菌株细菌生物膜形成量,微生物黏着碳氢化合物(MATH)法检测2种菌株细菌疏水率,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2种菌株细菌生物膜中S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(LuxS)mRNA表达水平.结果:随着传代次数(第0～10代)的增加,E.faecalis的MIC值逐渐升高.E.faecalis和E.faecalis-Cs的生长曲线无明显差异.透射电镜,E.faecalis和E.faecalis-Cs均呈椭圆形或双球型,细胞壁结构完整,边缘光滑,细胞质分布均匀,2种细菌形态大小和细胞壁厚度及完整性方面无明显差异.结晶紫染色法,与E.faecalis比较,E.faecalis-Cs生物膜形成量明显增加(P<0.05).MATH法,与E.faecalis比较,E.faecalis-Cs的细菌疏水率明显升高(P<0.05).RT-qPCR法,与E.faecalis比较,E.faecalis-Cs细菌生物膜中LuxS mRNA表达水平明显升高(P<0.05).结论:E.faecalis在反复暴露于氯己定后会产生耐药性,耐药菌株致病能力增强.群体感应(QS)系统 LuxS 基因高表达和更强的细菌生物膜形成能力可能是E.faecalis对氯己定产生耐药性的潜在机制.

目的 探讨康替唑胺、利奈唑胺对常见革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的体外抗菌活性,初步分析其抑制生物被膜的相关机制.方法 取革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌,采用微量肉汤稀释法测定康替唑胺、利奈唑胺对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC).通过生长曲线检测不同药物浓度下细菌生长情况,在不抑制细菌生长的药物浓度下通过结晶紫染色观察细菌生物被膜形成情况及生物被膜内细菌存活率.采用蛋白质组学筛选康替唑胺、利奈唑胺作用下革兰阳性菌生物被膜差异表达蛋白,基因本体(GO)功能注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析差异表达蛋白功能,蛋白质相互作用网络(PPI)观察蛋白之间相互作用关系.结果 康替唑胺及利奈唑胺对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌表现出广谱抗菌活性,被选入实验所用菌株MIC均≤4 μg/mL,生长曲线结果显示康替唑胺、利奈唑胺在1/2×MIC并未影响细菌生长,结晶紫染色及生物被膜存活菌计数显示亚抑菌浓度下两种药物能够抑制金黄色葡萄球菌、粪肠球菌生物被膜形成;康替唑胺、利奈唑胺作用下革兰阳性菌生物被膜差异表达蛋白分别为290、222个,差异蛋白主要涉及rpmJ、rplE、SasG、luxS、ald1、D-丙氨酸氨基转移酶等.GO注释分析显示,康替唑胺作用下差异表达蛋白主要与丙酮酸代谢过程、氨基酸代谢等过程相关;利奈唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及嘧啶代谢过程、嘌呤代谢、氨基酸代谢等过程.KEGG分析显示,康替唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及萘降解、嘧啶代谢、糖酵解、核糖体切除修复等过程;利奈唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及氨基酸降解、脂肪酸降解、嘌呤代谢、戊糖和葡萄糖磷酸盐转化过程.PPI网络分析显示,两种抗生素作用下的差异表达蛋白主要与核糖体相关.结论 康替唑胺及利奈唑胺对革兰阳性菌表现出广谱抗菌活性及生物被膜抑制效果,两种药物可能通过抑制群体感应系统、初级代谢及生物被膜形成相关基因来抑制革兰阳性菌生物被膜形成.

[目的]LuxS/AI-2型密度群体感应系统产生的自诱导信号分子AI-2 (AI-2的产生需要luxS基因编码的LuxS蛋白参与)参与对细菌众多生理功能的调控.探讨luxS对不同血清型禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenicity Escherichia coli,APEC)生物学特性的影响.[方法]本研究以APEC优势血清型APECO1 (O1血清型)、DE 17 (O2血清型)、E940 (O78血清型)及其相应luxS缺失株为研究对象,对野生株和缺失株的生长特性、生物被膜形成、rdar (red,dry and rough)形态、运动性和耐药性等特性进行分析.[结果]luxS基因的缺失不影响APEC生长特性,但导致APEC不能产生AI-2;此外,luxS基因的缺失显著降低APECO1和E940的生物被膜形成(P＜0.05),而DE17的生物被膜形成无显著变化.对各菌株的rdar形态和运动性检测结果表明,luxS基因的缺失改变了APECO1的rdar形态,对DE17和E940并无影响;显著降低了APECO1和DE17运动能力,对E940并无影响.荧光定量PCR检测结果表明,luxS基因的缺失显著降低APECO1、DE17和E940与细菌运动性相关的鞭毛基因fliG和liI的转录水平(P＜0.05).此外,对各菌株的耐药性检测结果表明,luxS基因缺失导致APECO1对头孢吡肟和丁胺卡那由耐药变为高敏,同时对氯霉素与E940相同由高敏变为耐药,但对DE17的耐药性无显著改变.[结论]luxS对APEC的生物学特性具有重要的调控作用,且这种调控具有菌株特异性.

目的·研究sahH基因在变异链球菌LuxS缺陷株内的表达对其胞外多糖合成的影响.方法·以构建的LuxS缺陷株转有sahH基因的sahH+luxS-SmUA159、LuxS缺陷株转有空质粒的PIB169+luxS-SmUA159(背景对照)及变异链球菌SmUA159野生株为研究模型.实时荧光定量PCR观察胞外多糖合成相关基因的转录水平,蒽酮法观察生物膜胞外多糖合成情况.结果· 与SmUA159和PIB169+luxS-SmUA159菌株相比,sahH基因转入株sahH+luxS-SmUA159的4种被检测基因(gtfA、gtfB、gtfC、gtfD)中,gtfA和gtfD转录水平有显著差异(均<0.05),而gtfB和gtfC无明显差异.SmUA159、PIB169+luxS-SmUA159和sahH+luxS-SmUA159胞外多糖合成量无明显差异.结论·sahH基因转入可影响变异链球菌胞外多糖合成相关基因的表达,但不影响细菌总体胞外多糖合成量.

肺炎链球菌可引起人类多种疾病,其通常无症状地定植在人类鼻咽部,当人体免疫力低下时可引起肺炎、中耳炎、脑膜炎等疾病.肺炎链球菌由定植菌转变为病原菌的机制仍不完全清楚,多项研究资料表明肺炎链球菌凭借群体感应(QS)系统分泌化学信号分子以促进细菌间的相互交流、启动靶基因转录以及增强细菌适应性与致病力.肺炎链球菌的QS系统主要包括ComABCDE系统、BlpABCSRH 系统、LuxS/AI-2系统,其生物学功能在促进肺炎链球菌对外源DNA的摄取和重组、生物膜形成、对竞争细菌的裂解等方面发挥重要作用,从而增强对宿主的定植和致病能力.

[目的]波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)是冷藏海产鱼类的特定腐败菌.研究群体感应信号AI-2/LuxS对鱼源S.baltica生物被膜和致腐的调控作用.[方法]扩增SBll分离株的luxS基因,用自杀性质粒构建luxS基因缺失株,通过结晶紫染色、珠涡流法、显微镜观察和HPLC,比较分析野生株与缺失株△luxS在4℃和28℃下生物被膜形成、粘附能力、泳动性和致腐产物的差异.[结果]S.baltica SB11中扩增获得luxS基因,生物信息学分析显示LuxS蛋白由169个氨基酸构成,含有保守的His-Thr-Leu-Glu-His (HTLEH)模体和关键氨基酸位点,蛋白三维空间结构与其他细菌相似.与野生株相比,△luxS缺失株上清荧光信号散失,但不影响生长,生物被膜形成期和成熟期的含量显著低于野生株,在4℃培养96 h和28℃培养24 h被膜分别减少20.1％和27.9％.缺失株在不锈钢片的粘附能力明显减弱,其中在4℃培养72 h和28℃培养24 h后的粘附量比野生株分别减少6.48％和6.57％.荧光显微镜观察发现,野生株能快速粘附于玻璃片,聚集形成大量生物被膜,而△luxS仅形成平坦稀疏的被膜,粘附细菌降低,CLSM证实野生株和△luxS的成熟被膜厚度分别为68.95 μm和36.44 μm.并且,△luxS株在4℃和28℃下泳动性均显著强于野生株.然而,野生株和△luxS株三甲胺和腐胺积累无差异.[结论]鱼源S.baltica中LuxS蛋白保守,AI-2/LuxS参与被膜、粘附能力及泳动性等多种生物被膜形成相关的调控作用,然而不是该菌致腐能力的功能性群体感应信号.

目的 rnc基因敲除后,观察变异链球菌的耐酸、耐氧化、耐高渗透压性能的改变及其可能的调节机制.方法 通过长链PCR连接诱变技术,构建rnc基因缺失突变株,分别对比突变菌株与野生菌株对氧化环境、酸性环境及高渗透压环境的耐受能力;采用real-time RT-PCR验证rnc缺失后变异链球菌环境耐受相关基因的转录水平表达变化.结果 rnc基因缺失后,变异链球菌的耐酸性(X2=13.464,P=0.001)及耐氧化性(X2=4.505,P=0.048)较野生菌株显著下降,但耐高渗透压性显著增加(X2=11.971,P=0.001).环境耐受相关基因luxS与ropA的表达水平显著下调(P<0.001),分别为野生菌株的0.64倍、0.51倍;而htrA与brpA的表达水平显著上调(P<0.001),分别为野生菌株的1.56倍、1.80倍.结论 rnc基因缺失影响变异链球菌环境耐受相关基因的表达,降低了变异链球菌耐酸、耐氧化能力,增强了对高渗透压的耐受能力.

变形链球菌是导致龋齿发生最主要的细菌.本实验采用带transwell小室的细胞培养板,从九株不同种属的益生菌中,筛选能有效抑制变形链球菌生物膜形成的菌株.通过筛选获得一株唾液乳杆菌ZM06,并探究其可能的作用机制.实验表明,菌株ZM06并不能直接杀死变形链球菌,但却能抑制变形链球菌生物膜形成.通过生物膜形成实验,扫描电镜观察以及相对定量与生物膜形成直接相关的基因(包括gtf B,gtfC,ftf,gbpB,gbpC)表达证实了这一点.更重要的是,菌株ZM06降低了变形链球菌调控生物膜形成的5条信号通路中关键基因的表达.荧光定量PCR表明,菌株ZM06不仅下调了之前报道的种间群体感应系统中调控生物膜形成的luxS基因的表达,而且还对其他4条调控这些基因的信号通路中的关键基因TCS-1 (vicK,vicR),TCS-2 (ciaH,c iaR),TCS-11 (hk11,rr11),TCS-13 (comD,comE)表达下调.之前还没有报道称益生菌可通过这4条信号通路影响变形链球菌生物膜的形成.本研究为益生菌预防龋齿的潜能提供了理论依据.

肠道内栖息着数量庞大且复杂的微生物菌群,是一个具有生物多样性的微环境,菌群在调节宿主肠道健康中发挥着重要作用.群体感应(quorum sensing,QS)是细菌间通过化学信号分子进行信息传递的重要方式.本文综述了QS系统组成、信号转导机制及AI-2/LuxS系统对肠道生物膜形成的调控,介绍了乳酸菌AI-2/LuxS QS系统及其在调控生物膜形成上的作用.通过肠道乳酸菌QS与生物膜形成综述分析,旨在为肠道屏障功能和健康调控提供新思路.