目的 探讨苦丁冬青苷D(kudinoside D,KD-D)对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导肝细胞脂质沉积的影响.方法 体外培养AML-12细胞,随机分为Control组、PA组、PA+KD-D 20 μmol·L-1 组、PA+KD-D 40 μmol·L-1 组和 PA+KD-D 80 μmol·L-1组.除Control组外,其他各组细胞加入PA(0.4 mmol·L-1)孵育 24 h,KD-D 在 PA 加入前 1 h 给予.MTT法检测细胞存活率;油红O染色和透射电子显微镜检测肝细胞脂质沉积;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧族;MitoSOX线粒体超氧化物红色荧光探针检测细胞线粒体超氧化物.结果 不同浓度KD-D明显改善PA诱导的肝细胞形态学改变.与Control组比较,PA组细胞内红色脂滴明显增加;与PA组比较,KD-D不同浓度干预的细胞内红色脂滴减少.透射电子显微镜结果提示,KD-D减少PA诱导的肝细胞脂肪变性并改善超微结构.此外,KD-D明显降低PA诱导的细胞活性氧水平(P＜0.01),降低细胞线粒体超氧化物含量(P＜0.01).结论 KD-D可抑制PA诱导的肝细胞脂质沉积,其机制可能与调控氧化应激反应有关.

目的 探讨苦丁冬青苷D(KD-D)对人HCC-1806 乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬的影响及机制.方法 将人HCC-1806 乳腺癌细胞作为研究对象,给予不同浓度KD-D处理后,采用CCK-8 法检测细胞存活率;EdU法检测细胞增殖能力;结晶紫染色法检测细胞克隆形成能力;流式细胞术(Annexin V-FITC/PI法)检测细胞凋亡;JC-1 染色法检测细胞线粒体膜电位;免疫荧光法检测细胞Cleaved Caspase-3、LC3、P62 蛋白表达;Western Blot法检测细胞Cleaved Caspase-3、Pan-AKT、Phosp-AKT、LC3Ⅱ蛋白表达;自噬双标mRFP-EGFP-LC3 腺病毒感染实验检测细胞自噬流.结果 与对照组比较,12.5、25、50、100、200、400 μmol·L-1 KD-D处理HCC-1806 细胞 24、48 h后,随着给药浓度增大和处理时间延长,细胞活性显著降低(P＜0.001),细胞内吸光度值显著降低(P＜0.001),细胞增殖受到抑制;60、80 μmol·L-1 KD-D组的细胞克隆形成计数显著减少(P＜0.001);50、100、150 μmol·L-1 KD-D组细胞的早期及晚期凋亡比例均显著升高(P＜0.05,P＜0.001);40、60、80 μmol·L-1 KD-D组的红色荧光比例显著下降(P＜0.001),绿色荧光比例显著升高(P＜0.01,P＜0.001),HCC-1806 细胞线粒体膜电位下降;60、80、100 μmol·L-1 KD-D组细胞的 Cleaved Caspase-3 蛋白表达均显著上调(P＜0.001),60 μmol·L-1 KD-D 组细胞的 Pan-AKT、Phosp-AKT 蛋白表达均显著上调(P＜0.001);60 μmol·L-1 KD-D组细胞的LC3 蛋白荧光小点数量显著增加(P＜0.001),P62 蛋白平均荧光强度显著降低(P＜0.001),LC3Ⅱ蛋白表达显著上调(P＜0.001),自噬小体及自噬溶酶体数量显著增加(P＜0.01,P＜0.001),自噬流激活.与 60 μmol·L-1 KD-D 组比较,KD-D+AKT 抑制剂(Afuresertib)组细胞的 Cleaved Caspase-3、Pan-AKT蛋白表达显著下调(P＜0.01,P＜0.001),Phosp-AKT蛋白表达显著上调(P＜0.001).结论 KD-D能抑制人乳腺癌HCC-1806 细胞增殖,并诱导其发生凋亡和自噬,KD-D诱导HCC-1806 细胞凋亡可能与激活AKT信号影响Cleaved Caspase-3 表达有关.

目的 采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-蒸发光检测器(HPLC-DAD-ELSD)联用技术,建立苦丁茶冬青叶的指纹图谱.方法 岛津C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,检测波长210 nm,柱温35℃.结果 通过10批苦丁茶冬青药材的指纹图谱,建立了共有模式,其中HPLC-DAD指纹图谱共有峰18个,相似度为0.911～0.970,HPLC-ELSD指纹图谱共有峰11个,相似度为0.914～0.962.结论 方法精密度、重现性、稳定性好,为客观评价苦丁茶冬青药材的质量提供了科学依据.

目的 优化苦丁茶冬青总皂苷生物转化工艺.方法 在单因素试验基础上,以初始pH值、发酵温度、发酵时间为影响因素,苦丁皂苷E转移率、苦丁皂苷D含有量为评价指标,正交试验优化生物转化工艺.结果 最佳条件为初始pH值6.0,发酵温度25℃,发酵时间7d,摇床转速120 r/min,苦丁皂苷E转移率55.52％,苦丁皂苷D含有量13.39％,纯度≥95％.结论 该方法简便稳定,成本低廉,可用于生物转化苦丁茶冬青总皂苷.

目的 研究不同产地10批次大叶冬青药材的HPLC指纹图谱与其黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制作用的谱效关系,初步揭示大叶冬青药材的药效物质基础.方法 HPLC法测定了10批次不同产地的大叶冬青药材样品,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版评价,建立共有模式,并进行主成分分析.采用HPLC法建立酶-底物反应体系,对不同批次的大叶冬青药材的XOD抑制活性进行研究,基于谱效关系,采用SPSS软件对数据进行相关性分析.采用氧嗪酸钾诱导建立小鼠高尿酸血症模型,检测小鼠血清中以及肝组织中尿酸(UC)、XOD水平变化.结果 10批次不同产地的大叶冬青药材HPLC指纹图谱中共有15个特征峰,其中峰11(苦丁茶冬青皂苷E)、14(苦丁冬青皂苷F)与XOD抑制作用呈中等程度相关,峰5(未鉴定)、6(山柰酚-3-D-β-D-芸香糖苷)、7(异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷)、10(大叶冬青皂苷C)、13(大叶冬青皂苷D)相关性最强.由主成分分析可知,峰9(大叶冬青皂苷H)的量在大叶冬青药材质量控制中起到至关重要的作用.体内实验结果表明,大叶冬青提取物高、中、低剂量组均能显著降低小鼠血清UC和XOD水平,抑制肝组织中XOD活性,并呈现一定的量效关系.结论 10批不同产地的大叶冬青药材对XOD均有较强的抑制作用,HPLC指纹图谱显示出7个共有峰对应的化合物与该药效存在一定的相关性.

目的 建立HPLC法测定大叶冬青叶中羽扇豆醇、豆甾醇、α-香树脂素和苦丁冬青苷D含量的方法 ,对比分析26批来自不同产地及不同采收期大叶冬青叶中4种成分的含量,为其质量标准的完善提供参考.方法 采用YMC-ODS C1(8 4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)为流动相等度洗脱,流速1 mL·min-1,检测波长205 nm,柱温30℃,进样量20 μL,建立同时测定羽扇豆醇、豆甾醇、α-香树脂素含量的方法 ;以乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)为流动相等度洗脱,流速1 mL·min-1,检测波长254 nm,柱温30 ℃,进样量10 μL,建立测定苦丁冬青苷D含量的方法 .结果 在上述色谱条件下羽扇豆醇、豆甾醇、α-香树脂素分离度良好,分别在质量浓度18.88～906.00 μg·mL-(1 r=1.000 0,n=6)、15.06～723.00 μg·mL-(1 r=0.999 9,n=6)、22.75～1 092.00 μg·mL-(1 r=0.999 9,n=6)呈良好的线性关系,平均加样回收率(n=6)分别为100.43%(RSD=1.96%)、98.72%(RSD=0.88%)、102.86%(RSD=2.47%).苦丁冬青苷D在质量浓度9.55～573.00 μg·mL-(1 r=0.999 9,n=6)呈良好的线性关系,平均加样回收率为101.35%(RSD=0.25%).结论 所建立的测定方法 简单方便、结果 准确、重复性好,可用于测定大叶冬青叶中羽扇豆醇、豆甾醇、α-香树脂素和苦丁冬青苷D的含量,为大叶冬青质量标准的建立提供理论依据.不同产地及不同采收时期大叶冬青叶中4种三萜类成分含量存在明显差异.

目的 观察大鼠离体肠道菌群对苦丁茶冬青叶中苦丁茶冬青皂苷D厌氧代谢的影响.方法 健康SD大鼠新鲜粪便制备的肠道菌群混悬液与苦丁茶冬青皂苷D体外厌氧培养后,收集代谢产物,采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱;流动相水(含0.1％甲酸)-甲醇(含0.1％甲酸),梯度洗脱.应用LTQ-Orbitrap质谱正离子模式分析苦丁茶冬青皂苷D的代谢产物.结果 根据精确相对分子质量数据和特征离子碎片,从肠道菌群培养液中检测出4个代谢产物,主要代谢途径是脱糖反应.结论 离体培养的大鼠肠道菌群可对苦丁茶冬青皂苷D进行代谢,为进一步研究其体内代谢过程提供了科学依据.