目的 通过全基因组测序对甘肃省市售食品中分离的单增李斯特菌和英诺克李斯特菌基因组特征进行比较分析.方法 收集2021-2022年甘肃省市售食品中分离的25株单增李斯特菌和7株英诺克李斯特菌作为研究对象,对菌株进行全基因组测序,分析其系统发育谱系、克隆复合群(CC)、序列型(ST)、毒力基因、抗性基因及泛基因组.结果 32株李斯特菌分属单增李斯特菌谱系Ⅰ和Ⅱ及英诺克李斯特菌3个群,单增李斯特菌分为10个亚群,英诺克李斯特菌分为5个亚群,与CC型保持一致,核心基因组多位点序列分型能将各谱系中不同CC型的菌株明显分开,谱系Ⅰ与英诺克李斯特菌的进化关系更近.25株单增李斯特菌均携带李斯特菌毒力岛LIPI-1和内化素基因,不携带LIPI-3,有2株ST87型菌株携带LIPI-4;7株英诺克李斯特菌均不携带LIPI-1和内化素基因,均携带LIPI-4,有5株菌携带LIPI-3.单增李斯特菌有16株携带SSI-1、3株携带SSI-2,7株英诺克李斯特菌均不携带SSI-1,有6株携带SSI-2.李斯特菌的泛基因组大小随着测序基因组数目的增加呈现线性增多,25株单增李斯特菌当菌株数量达到15后核心基因数目稳定在2 272个,占泛基因组基因数目的46.2％,25株单增李斯特菌和7株英诺克李斯特菌共同的核心基因1487个,当菌株数量达到10后数目趋于稳定.结论 核心基因组多位点序列分型可将不同谱系不同克隆复合群的李斯特菌进行区分,英诺克李斯特菌与单增李斯特菌生化特性相似与其亲缘关系相近有关,致病性差异与英诺克李斯特菌缺失单增李斯特菌特有的毒力基因相关.

目的 建立单核细胞增生李斯特菌hlyA基因TaqMan探针实时荧光PCR,用于食品卫生检验的快速筛查.方法 根据单核细胞增生李斯特菌hlyA基因设计特异的引物与TaqMan探针,建立和优化实时荧光PCR反应体系,评估其特异性、灵敏度、稳定性,并在食品卫生检验中与细菌分离方法同步应用比较.结果 建立了单核细胞增生李斯特菌TaqMan探针实时荧光PCR反应体系,经优化其最佳退火/延伸的温度为58℃,25 μL反应体系中上、下游引物和探针最佳终浓度配比分别为0.7、0.7、0.4 μmol/L;该实时荧光PCR反应体系可在35 min内完成检测,与沙门菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌等16种非目标菌无交叉反应,对阳性克隆质粒的检测下限可达100拷贝/μL的稀释梯度,对同一核酸浓度样本20次检测的Ct值变异系数为0.46％;在对120份食品安全风险监测标本的快速检测应用中,6份标本单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR扩增阳性,从相应样本中分离出6株单核细胞增生李斯特菌,实时荧光PCR与分离培养方法检测结果相一致.结论 针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因建立的TaqMan探针实时荧光PCR具有快速、特异、灵敏、稳定等优势,可用于食品卫生检验中单核细胞增生李斯特菌的快速、高效筛查.

目的 了解某奶牛场奶牛粪便中李斯特菌的携带情况及其分离株的遗传特征.方法 用ISO 11290方法分离196份奶牛粪便样本中的李斯特菌,对分离的伊氏李斯特菌进行全基因测序,用MEGA6.0构建系统发育树,网站在线比对分析伊氏李斯特菌株的毒力基因、耐药基因及前噬菌体等.结果 196份奶牛场养殖的奶牛粪便样本中有9份样本为李斯特菌阳性,其中3株为伊氏李斯特菌伊氏亚种,6株为英诺克李斯特菌,分离率分别为1.53％和3.06％.3株伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株具有包括LIPI-1和LIPI-2在内的绝大部分致病性李斯特菌毒力相关基因,携带一个不完整的前噬菌体及22个耐药相关基因.结论 养殖场奶牛粪便中携带伊氏李斯特菌伊氏亚种.对伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株的全基因组、毒力基因、耐药基因、前噬菌体基因等遗传特征分析,为进一步分析其致病性提供了参考.

单核细胞增生李斯特菌( listeria monocytogenes,LM)是革兰氏阳性菌,属厚壁菌门,由英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现,国际上公认的李斯特菌共有十个菌株:LM、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌、默氏李斯特菌、L. rocourtiae、L. fleischmannii、L. weihenstephanensis.其中LM是唯一能引起人类疾病的,它的易感人群为新生儿、孕妇、老年人和免疫功能缺陷者,特别是妊娠期妇女,因其可通过胎盘屏障,故可导致宫内感染继发流产、早产、死产和新生儿败血症等严重并发症,且被感染的胎儿和新生儿预后极差,病死率高,临床上统称为李斯特菌病.

目的 建立检测单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)化学发光法并进行验证.方法 以单增李斯特菌免疫原分别免疫BALB/c小鼠及新西兰大白兔,制备鼠源单抗和兔血清多抗,建立检测单增李斯特菌化学发光免疫法,优化兔血清多抗包被浓度及单增李斯特菌反应时间,验证方法的检测范围、灵敏度、特异性、准确性及稳定性.结果 制备的单增李斯特菌兔血清多抗及鼠源单抗效价分别为1∶256000和1∶128000.兔血清多抗最适包被浓度为0.05 mg/mL,与单增李斯特菌最适反应时间为40 min.该方法检测单增李斯特菌浓度范围为1 × 101 ～1×107 CFU/mL,灵敏度小于10 CFU/mL;除单增李斯特菌ATCC19115外,单增李斯特菌CMCC54003、CMCC54004、英诺克李斯特菌也可检测到,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌,沙门菌未检出;添加1×104 CFU/mL单增李斯特菌的火腿肠、牛奶及冰激凌溶液中回收率分别为90.3％、101.6％和969.3％;包被好的化学发光板密闭封装37℃放置28 d后,单增李斯特菌发光值为初始包被值的75.3％.结论 成功建立了检测单增李斯特菌化学发光法,该方法具有检测时间短、范围宽,特异性强等特性,为促进食品安全检测提供了参考依据.

李斯特菌是 1926 年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的.为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特,1940 年第三届国际微生物学大会上将其命名为李斯特菌[1].国际上公认的李斯特菌共有以下 7 个菌株:单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌、格雷李斯特菌、默里李斯特菌[2].其中单核细胞增生李斯特菌是唯一能够引起人类疾病的人畜共患病病原菌,中毒严重的可引起血液和脑组织感染.它主要通过粪—口途径感染,还可通过眼及破损皮肤、黏膜进入体内而造成感染.它广泛存在于自然界中,食品中存在的单核细胞增生李斯特菌对人类的安全具有危险,该菌在 4 ℃的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一[3].现对2016 年7 月至2020 年7 月本院收治的单核细胞增生李斯特菌感染患者的临床特点进行回顾性分析.

目的 对生禽肉中分出的1株可疑李斯特菌进行鉴定分析和总结,为不典型单核细胞增生李斯特菌的检测提供参考,避免造成漏检.方法 通过染色镜检,溶血试验,动力试验,李斯特菌显色平板上菌落形态观察对可疑菌进行初步鉴定,然后分别用梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统、梅里埃基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)系统、16S rRNA 序列分析和全基因组测序对可疑菌进行鉴定.结果 VITEK 2 Compact鉴定该菌为英诺克李斯特菌,MALDI-TOF MS、16S rRNA和全基因组测序鉴定该菌为单核细胞增生李斯特菌.结论 该菌为单核细胞增生李斯特菌.鉴定非典型分离株时,可能会被自动化系统误判,建议通过分子生物学方法或MALDI-TOF MS对李斯特菌分离株进行确认.