目的 通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证.方法 采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding(简称VIPS系统)筛选单克隆,经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数,确定候选克隆;将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒,根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞.结果 驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养,倍增时间为20～24 h;通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯,以0.5 × 106个/mL的细胞密度接种,培养7 d最高细胞密度可达8.27 × 106个/mL,活率不低于80％,平均倍增时间20.31h,能较好地表达外源基因.结论 通过无血清驯化培养,成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株.

目的 采用Plackett-Burman实验和响应面法(response surface methodology,RSM)优化酵母源无血清培养基(serum-free medium,SFM)的营养组分,明确培养基成分及浓度.方法 以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为研究对象,在实验室前期筛选出的SFM的基础上,采用Plackett-Burman实验对10种营养组分进行筛选.筛选出对细胞具有促生长作用的因素后,利用RSM进行二次优化,以阐明各变量间的相互作用,确定促CHO细胞生长的最佳培养基组成.取对数生长期CHO细胞,用优化后的培养基重悬后,进行传代扩增.结果 经Plackett-Burman实验筛选的10个变量中,酵母抽提物(yeast extract,YE)FM888和微量元素能有效提高细胞比生长速率;非必需氨基酸和FM888对提高细胞存活天数作用显著;FM888、必需氨基酸、非必需氨基酸及微量元素能显著提高活细胞密度.综合选择FM888、微量元素和非必需氨基酸3个因素进行RSM优化试验.优化后的培养基悬浮培养CHO细胞时,其最大比生长速率可达0.025/h,存活天数可达6 d,最大活细胞密度可达7.187 × 106个/mL.将优化后的培养基进行细胞稳定传代试验,可稳定传代12代,其活细胞密度及细胞活率与对照组(商业化SFM)接近.结论 成功获得成分明确且能支持CHO细胞高密度生长的酵母源SFM,为YE在动物细胞培养中的应用以及高效SFM的开发提供了参考和依据.

目的 制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)收获物,纯化后免疫日本大耳白兔,制备VZV抗血清,并进行各项检定.方法 将VZV Oka株(vOka)在人二倍体细胞2BS株中传代培养,病毒收获后经超速离心纯化,制备免疫原,与弗式佐剂混合后经背部多点注射免疫雌性日本大耳白兔5只,制备VZV抗血清.Western blot检测血清抗体的特异性;测定膜抗原荧光抗体(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)效价和血清抗体中和效价,并对两种检测方法的结果进行相关性分析.利用抗体效价较高的血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒进行异种病毒干扰试验.结果 制备的VZV抗血清可特异性结合vOka和Oka-7S病毒收获物及gE和ORF7蛋白等多种VZV抗原;3免血清FAMA抗体效价可达1∶16 384,血清抗体中和效价达1∶256;根据Karl Pearson相关系数分析得出两种检测方法结果呈线性相关.异种病毒干扰试验中试验组与对照组病毒滴度差值均＜0.50 lgCCID50/mL,表明VZV抗血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒滴度均无干扰.结论 成功制备了特异性强,亲和力高的VZV抗血清,为VZV成分疫苗的检定奠定了基础.

黑色素瘤细胞黏附分子CD146作为一种新的内皮细胞标志物,其表达与肿瘤、自身免疫性疾病的进展密切相关.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以对称性、慢性多关节炎症为特征表现的系统性自身免疫性疾病,滑膜血管翳作为RA的代表性病理产物在疾病的发生发展中起着重要作用.为了研究CD 146分子在人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human rheumatoid arthritis fibroblast like synovial cell,HFLS-RA)条件培养液状态下的人脐静脉内皮细胞株 EAhy.926 的基因表达差异及其影响机制,本研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制EAhy.926细胞中CD146的表达.培养并提取HFLS-RA上清液制备条件培养液.将转染后的EAhy.926细胞用HFLS-RA条件培养液培养24 h构建RA损伤模型,并对其进行转录组测序,筛选出差异表达基因(differentiallly expressed genes,DEGs),并通过GO、KEGG通路分析,探索CD146调控的DEGs主要参与的相关信号通路及生物学过程.结果显示,与对照组细胞相比,HFLS-RA条件培养液状态下CD146敲低的EAhy.926细胞有341个DEGs,其中上调基因有173个,下调基因有168个;GO、KEGG通路分析发现DEGs主要富集在Wnt信号通路、PPAR信号通路、TRP通道的炎症介质调节、脂肪细胞因子信号通路上,参与了细胞黏附、细胞运动、细胞定位、半胱氨酸生物合成过程等生物过程.本研究通过转录组学分析发现在HFLS-RA条件培养液状态下,CD146分子可能通过多条关键信号通路及多个基因影响EAhy.926.研究结果为探讨CD146分子在类风湿关节炎滑膜血管生成中的作用及机制的研究提供了理论依据.

目的:探讨冠心病患者血清视黄醇结合蛋白4(RBP4)、胱抑素C(CysC)的水平及其与肠道菌群的关系.方法:选择2019年12月至2020年12月在我院重症医学科就诊的97例冠心病患者作为冠心病组,99名同期健康体检者作为对照组.比较两组血清RBP4、CysC水平及肠道菌群阳性率及数量.以冠心病患者血清RBP4、CysC平均水平为界,将其分为血清RBP4高水平组(RBP4≥35.97 ng/ml)53例和低水平组(RBP4＜35.97 ng/ml)44例,血清CysC高水平组(CysC≥1.49 ng/ml)49例和低水平组(CysC＜1.49 ng/ml)48例.比较不同水平组菌群数量,采用Pearson法分析RBP4、CysC水平与菌群数量的相关性.结果:与对照组比较,冠心病组RBP4、CysC水平均显著升高,双歧杆菌属、厚壁菌、乳酸杆菌属、变形杆菌的培养阳性率及菌群数量均显著降低(P均＜0.001),葡萄球菌、大肠埃希菌的培养阳性率及菌群数量均显著升高(P均＜0.001).与RBP4低水平组比较,RBP4高水平组双歧杆菌、厚壁菌、乳酸杆菌、变形杆菌数量均显著减少,葡萄球菌、大肠埃希菌数量显著增加(P均＜0.001);与CysC低水平组比较,CysC高水平组双歧杆菌、厚壁菌、乳酸杆菌、变形杆菌数量显著减少,葡萄球菌、大肠埃希菌数量显著增加(P均＜0.001).Pearson相关分析显示,RBP4水平与双歧杆菌属、厚壁菌、乳酸杆菌属、变形杆菌数量呈显著负相关(r=-0.626～-0.482,P均＜0.001),与葡萄球菌、大肠埃希菌数量显著正相关(r=0.302、0.337,P均＜0.01);CysC水平与双歧杆菌属、厚壁菌、乳酸杆菌属、变形杆菌数量呈显著负相关(r=-0.621～-0.502,P均＜0.001),与葡萄球菌、大肠埃希菌数量呈显著正相关(r=0.308、0.340,P均＜0.01).结论:冠心病患者血清RBP4、CysC水平升高,且与肠道菌群组成密切相关.

目的 原核可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,纯化后免疫小鼠,检测其免疫原性,为SARS-CoV-2候选疫苗的制备提供新的思路.方法 扩增SARS-CoV-2 RBD蛋白基因片段,酶切后与pNCMO2表达载体连接,构建重组表达质粒pNC-RBD.将重组原核表达质粒转化入短小芽孢杆菌感受态细胞,扩大培养并降温诱导蛋白表达.利用亲和层析纯化目的蛋白,经氢氧化铝佐剂吸附后经背部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,以仅免疫铝佐剂为对照,每组10只.ELISA法检测体液免疫效果,体外增殖试验测定细胞免疫效果,ELISA法测定多种细胞因子的体外分泌,流式细胞术测定细胞分型.结果 重组表达质粒pNC-RBD经菌落PCR及测序证明构建正确.重组蛋白相对分子质量约22 000,可分泌表达.纯化后重组蛋白纯度达95％以上.免疫小鼠后血清结合抗体和中和抗体效价分别可达1∶10000和1∶750左右,均显著高于佐剂组(t分别为2.845和2.528,P均＜0.01);体外可刺激淋巴细胞增殖,并促进IL-1β及IFNγ的分泌;细胞分型试验结果表明促进了CD4+和CD8+T细胞淋巴细胞增殖.结论 成功可溶性表达了SARS-CoV-2 RBD蛋白,其免疫原性良好,为以RBD蛋白为基础研制SARS-CoV-2基因工程疫苗奠定了基础.

目的:提高临床医师对产气荚膜梭菌罕见并发症的认识。方法:回顾性分析烟台毓璜顶医院2023年2月收治的1例产气荚膜梭菌感染致血管内溶血并肝脓肿患者的临床资料并检索国内外相关文献，对该病的致病机制、临床特征及诊疗进行探讨。结果:该老年男性患者因急性胰腺炎合并腹腔感染入院，既往糖尿病病史。入院第2天，患者出现呼吸急促、胸闷憋气及酱油色尿，血红蛋白：63 g/L、总胆红素：64.9 μmol/L、间接胆红素：55.1 μmol/L，提示血管内溶血；血涂片示球形红细胞，血培养报产气荚膜梭菌；腹部CT及超声示肝脓肿，综合考虑为产气荚膜梭菌所致急性血管内溶血合并肝脓肿。在给予充分抗感染、血浆置换及其他对症支持治疗后患者病情好转，转入普通病房。结论:产气荚膜梭菌感染合并血管内溶血及肝脓肿是一种罕见的并发症，病死率极高。临床医生应早期识别、诊断和治疗，以改善患者预后。

患者，男性，41岁。2021年10月29日因双眼疼痛难忍加重3个月余，于保定市第一中心医院眼科就诊。主诉近3个月余于多家医院就诊，给予加替沙星、更昔洛韦、小牛血凝胶、玻璃酸钠、生长因子、普拉洛芬及自体血清等多种眼药治疗(用法用量不详)，症状无缓解且逐渐加重。曾于外院多次行细菌及真菌微生物检查，结果均为阴性。既往肾衰竭病史4年，2型糖尿病病史1年。双眼裸眼视力眼前手动，右眼眼压18 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，左眼眼压16 mmHg，双眼泪河极窄，结膜充血，角膜上皮大片剥脱，中央角膜坏死溶解，有溃疡灶，右眼较左眼严重。见图1。经疼痛数字等级量表评估，结果显示患者疼痛程度为8分，即重度疼痛，无法安静就坐，全身大汗。泪液分泌试验检查结果显示双眼均为1 mm/5 min。免疫相关化验检查结果显示类风湿因子、红细胞沉降率、抗链O及C反应蛋白等均为阴性。经进一步询问，主诉既往有外院住院史，并行盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉剂(生产厂家不详)点眼缓解疼痛，此后频繁使用此药点眼，>10次/d，3个月余。结合患者用药史、眼部表现及全身病史，诊断为双眼药物毒性角膜炎，双眼角膜溃疡，双眼重度干眼。经专家组讨论，停用患者目前眼部用药，当日给予双眼角膜溃疡清创联合双眼病灶羊膜覆盖手术治疗，并给予妥布霉素地塞米松膏(比利时s.a.ALCONCOUVERURn.v.公司生产)，2次/d；小牛血去蛋白提取物眼用凝胶(沈阳兴齐眼药股份有限公司生产)点双眼，3次/d；术后第3 d双眼羊膜脱落，但患者自觉疼痛缓解，见图2。遂再次给予双眼羊膜覆盖治疗，术后10 d双眼羊膜再次脱落，患者疼痛缓解明显。经疼痛数字等级量表再次评估，结果显示患者疼痛程度为5分，即中度疼痛，可安静平卧或坐位，疼痛持续但可耐受。2021年12月5日复查，患者裸眼远视力右眼0.05，左眼0.08；右眼眼压17 mmHg，左眼眼压15 mmHg，双眼泪河仍窄，结膜充血减轻，角膜上皮仍可见大片剥脱，中央角膜坏死区好转，溃疡灶愈合。考虑角膜上皮持续缺损未愈，随后给予患者第3次羊膜覆盖治疗，同时加用0.05%环孢素滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司生产)点眼，2次/d，以改善眼表微环境。7 d后患者再次因右眼疼痛难忍就诊，右眼视力光感，左眼0.1，右眼结膜混合充血，角膜黄绿色脓苔覆盖，眼内结构不明，左眼前节无变化。见图3。进一步行右眼病灶清创联合病原微生物检测，CX23型电子显微镜(日本奥林巴斯株式会社生产)下细菌涂片可见细菌阳性，细菌培养结果显示绿脓杆菌阳性。眼部Mylab Seven型彩色多普勒超声检查(意大利百胜集团生产)结果提示前房及后节无明显炎性混浊，暂排除眼内炎可能。再次追问患者回家用药史，患者自诉除医嘱用药，其双眼仍在自行点盐酸丙美卡因滴眼液，但用药次数较治疗前明显减少，且其部分术后滴眼液瓶盖丢失，瓶口外漏表面污浊，有明显的点眼操作不洁情况。由于右眼出现严重细菌感染，再次调整治疗方案，频点加替沙星眼用凝胶(沈阳兴齐眼药股份有限公司生产)及妥布霉素滴眼液(比利时s.a.ALCON－COUVREURn.v公司生产)治疗1 d无效，遂急诊行右眼穿透性角膜移植联合白内障吸除后房型人工晶状体植入术。左眼因持续角膜上皮不愈合和角膜溃疡于右眼术后15 d亦行左眼穿透性角膜移植手术，术后常规加替沙星眼用凝胶和妥布霉素滴眼液治疗。右眼角膜移植术后1个月右眼裸眼视力0.1，左眼裸眼视力0.2；右眼眼压15 mmHg，左眼眼压14 mmHg；双眼角膜植片透明，缝线在位，前房清晰，瞳孔散大欠圆，右人工晶状体正位，左眼晶状体混浊。见图4。

目的:探讨外周血肝素结合蛋白(HBP)、中性粒细胞CD64指数(CD64)、中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)联合检测在血流感染(BSI)诊断中的价值.方法:选取本院2020-01-2021-12血培养阳性患者108例为感染组,同期血培养阴性患者152例为对照组,比较两组血HBP、CD64和NLR水平差异,采用ROC曲线分析HBP、CD64和NLR对BSI的诊断价值.结果:感染组HBP、CD64、NLR水平显著高于对照组(P＜0.05).HBP、CD64和NLR对BSI诊断具有一定的参考价值,其ROC曲线的AUC(95％CI)、灵敏度和特异度分别为0.852(0.803,0.893),80.56％、83.55％;0.740(0.683,0.793),75.00％、65.79％;0.787(0.732,0.835),72.22％、76.97％;三项指标联合应用的AUC为0.917(0.877,0.948),诊断灵敏度和特异度分别为85.19％、86.84％.结论:HBP、CD64、NLR在BSI的快速诊断方面具有较高的参考价值.

再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是一种骨髓造血功能障碍的疾病,其发病机制十分复杂,与造血微环境失调、免疫紊乱、药物与辐射等多种因素相关.骨髓脂肪化是AA骨髓病理学最典型的特征之一.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells,BMSCs)由早期的中胚层细胞发育而来,主要分布于结缔组织和器官间质中[1],具有自我更新、增殖分化为多种细胞等的潜能.20世纪60年代Friedenstein等[2]首次从骨髓中提取BMSCs,BMSCs表面可表达CD105和CD73.此后不同学者从脐带血、脂肪、牙髓、外周血等中分离、培养得到BMSCs,并通过基础实验验证其在免疫调控、造血分化、组织再生等方面的作用.研究表明,AA患者相较健康个体而言BMSCs成脂分化增加[3],通过分泌脂肪酸和其他活性因子影响骨重塑,这一现象可影响BMSCs正常免疫调节和造血支持功能,并促进疾病的进展[4].本文总结了国内外最新研究成果,在骨髓过度脂肪化与AA发病机制之间的联系进行了梳理与总结,以期更深入地了解AA发病机制,为药物筛选与应用提供理论基础.