目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

目的 构建烟曲霉bem46基因过表达株,探究bem46基因过表达情况下对烟曲霉极性生长及与其他极性基因的相互作用关系.方法 原生质体法构建烟曲霉bem46过表达株;激光共聚焦显微镜观察烟曲霉bem46过表达时的绿色荧光定位;观察记录烟曲霉Ku80、烟曲霉bem46基因缺陷株(Δbem46)和烟曲霉bem46过表达株的发芽率;记录烟曲霉Ku80、Δbem46和过表达株菌落径向生长情况;光学显微镜下观察乳酸酚棉蓝染色的烟曲霉bem46过表达菌落生长情况;实时荧光定量PCR方法测定烟曲霉Ku80、Δbem46和过表达株中有关极性生长的基因的相对表达量.结果 利用原生质体法成功构建烟曲霉bem46的过表达株;激光共聚焦显微镜观察到bem46过表达时绿色荧光大量聚集在孢子头部位,而菌丝中几乎无荧光显示;相比于Ku80正常状态的发芽情况,bem46过表达株的发芽时间提前,而Δbem46株的发芽时间滞后;Ku80株、Δbem46和过表达株的径向生长差异无统计学意义;经过乳酸酚棉蓝染色以及显微镜下的观察,发现Ku80株、Δbem46和过表达株的孢子头形态有明显的差异,bem46过表达时可明显刺激孢子头膨大;通过测定烟曲霉Δbem46和bem46过表达株中极性生长基因的相对表达量,发现不论bem46基因在烟曲霉中缺失还是过表达,烟曲霉中cdc24、bem1、bem3、bud5、rsr1以及rasb基因的相对表达量均明显降低,cdc24表达量变化不大.结论 bem46基因可以促进烟曲霉孢子萌发,影响烟曲霉极性生长过程中的孢子和菌丝形态;在相关基因的信号转导通路中,bem46基因可能参与cdc42有关的极性生长信号转导通路.

目的:分析皮肤化脓性感染部位分离的金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）耐药、毒力及分子流行病学特征，为临床抗感染用药提供实验依据。方法:收集内蒙古医科大学附属医院2020年5-12月皮肤科住院患者皮肤化脓性感染部位及鼻腔分泌物样本进行细菌分离培养。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定疑似金葡菌菌落，用微量肉汤稀释法进行药物敏感性试验，PCR扩增金葡菌毒力基因，实时荧光定量PCR检测tsst-1、pvl、hla、clfA 4种毒力基因在不同来源金葡菌菌株中的相对表达量。对金葡菌菌株进行多位点序列分型（MLST）。耐药率及毒力基因检出率比较采用 χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料组间比较采用 t检验或曼-惠特尼 U非参数检验。 结果:在210例住院患者中，共分离金葡菌85株，包括皮肤化脓性感染部位54株（病例组），鼻腔部位31株（对照组）。药敏试验结果显示，85株金葡菌中14株为耐甲氧西林金葡菌（MRSA）。85株菌对青霉素耐药率[90.59%（77/85）]最高；对克林霉素和红霉素耐药率分别为60.00%（51/85）、61.18%（52/85），未发现对利福平、万古霉素和利奈唑胺耐药菌株。PCR显示，病例组菌株pvl基因检出率（33.33%，18/54）高于对照组（12.90%，4/31， χ2 = 4.28， P = 0.038）。实时荧光定量PCR显示，对照组菌株clfA相对表达量[3.87（2.30，5.94）]高于病例组[1.63（0.95，2.62）， P = 0.007]。85株金葡菌分型共得到17个ST型别，其中主要优势型别为ST398-甲氧西林敏感金葡菌（20/71）和ST22-MRSA（9/14）。ST22-MRSA菌株毒力基因pvl检出率（14/14）明显高于非ST22型MRSA（0， P < 0.001）。 结论:皮肤化脓性感染部位分离的金葡菌对青霉素、克林霉素和红霉素耐药率较高，这些抗生素不应作为临床经验治疗的首选药；皮肤金葡菌感染性疾病发病可能与毒力基因pvl有关；金葡菌鼻腔定植可能与clfA基因有关。

目的 评估亚洲璃眼蜱在普氏野马分布区域传播疾病的潜在风险,研究雌、雄蜱在宏基因组水平的特征并进行病原体分析.方法 2022年4月,在新疆卡拉麦里山有蹄类自然保护区使用"守株待蜱"法采集硬蜱,利用体视镜进行形态学鉴定,提取48只蜱(雌、雄各24只)DNA,PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶第1亚基(COⅠ)序列进行分子生物学鉴定.将雌、雄亚洲璃眼蜱分组进行宏基因组测序,非冗余基因集与非冗余蛋白(NR)数据库进行比对,分析蜱携带的微生物群落组成;与京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库和抗生素抗性基因数据库(ARDB)进行比对,获取蜱及蜱传病原体的基因功能注释结果以及抗生素抗性功能注释结果.数据的比较采用t检验分析.结果 共采集硬蜱124只,经形态学鉴定亚洲璃眼蜱成虫119只.硬蜱DNA扩增出约700 bp的阳性条带,经测序与亚洲璃眼蜱(GenBank:MH459386.1)的序列一致性为99％～100％.宏基因组测序经质控过滤共获得469 327 812条序列读长,开放阅读框预测得到836 843～1 094 994条序列.NR数据库比对结果显示,亚洲璃眼蜱携带的细菌菌落丰度占注释到的总群落丰度的99.13％,共注释到细菌32门2 040种,变形菌门和放线菌门为优势菌门,分别占细菌群落丰度的51.52％和44.35％;嗜吞噬细胞无形体为优势菌种,占细菌群落丰度的16.35％.病毒菌落丰度占注释到的总群落丰度的0.004％,共注释到病毒5 门 21种.雌蜱和雄蜱携带的细菌群落和病毒群落的丰富度及多样性差异均无统计学意义(t=-1.180、-1.729,均P＞0.05).KEGG基因功能注释到亚洲璃眼蜱新陈代谢基因占比最高(54.38％),主要的功能条目为氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜转运等;共识别出11 352种蛋白通路,其中154种蛋白通路在雌蜱和雄蜱间的差异有统计学意义(t=-2.348,P＜0.05).ARDB注释到亚洲璃眼蜱携带154种抗生素抗性基因,包括49种抗性基因类型,主要抗性基因类型为Baca(占62.53％),抗生素类型为肝菌肽.大部分注释到的抗性基因与多重耐药相关,如Mexf、Mexb、Emrd、Mexw等.雌蜱和雄蜱在抗生素抗性基因类型的差异性对比结果显示,仅雌蜱的Emrd基因抗性高于雄蜱(t=-7.558,P＜0.05).结论 本研究在宏基因组水平上揭示了亚洲璃眼蜱携带的主要细菌、病毒群落及多重耐药相关的抗生素抗性基因,雌蜱及其携带的病原体具有较高的物种丰度和基因丰度.

为探讨疫苗候选抗原—结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）通过黏膜接种诱导的保护性免疫效应。动物实验均使用6~8周龄雌性C57BL/6小鼠。30只小鼠接受不同的免疫接种策略，采用随机数字表法分为对照组、早期分泌抗原靶蛋白-6（ESAT-6）滴鼻组、HBHA滴鼻组、BCG初免PBS对照组、BCG初免HBHA加强组，每组6只。通过检测免疫后小鼠血浆白细胞介素17A（IL-17A）等细胞因子水平；肺IL-17A mRNA相对表达量（RQ）；肺三级淋巴结构的形成，及与其形成相关的趋化因子的检测；脾Th1、Th17细胞比例比较，从而分析免疫效应。BCG初免PBS对照组和BCG初免HBHA加强组（每组各30只小鼠），用BCG滴鼻模拟感染。在感染后预设的时间点做肺组织菌落计数，以评估细菌清除效率。多组间比较采用单因素方差分析，事后分析采用 LSD检验；两组间比较采用独立样本 t检验。结果显示，免疫后的小鼠血浆细胞因子IL-17A水平和肺IL-17A mRNA相对表达量，在BCG初免HBHA加强组［（14.76±4.73）pg/mL，RQ 为（12.27±6.71）］中最高，比对照组［（5.57±2.95）pg/mL，RQ为（1.30±0.97）］明显升高（ t=4.213， P<0.001； t=5.984， P<0.001），也显著高于BCG初免PBS对照组［（6.81±2.18）pg/mL，RQ 为（1.44±1.16）］（ t=3.646 P=0.001； t=6.185 P<0.001）。脾脏Th17细胞比例，与BCG初免PBS对照组（0.38±0.38）%比较，BCG初免HBHA加强组（1.02±0.34）%显著增高（ t=-0.280， P=0.048），该组在肺部诱导形成了三级淋巴结构，并在感染的早期降低了肺细菌负荷。综上，HBHA通过黏膜递送可有效增强BCG接种后的免疫保护效应，可能是一种有潜力的候选疫苗组分。

目的：:观察局部应用螺旋藻多糖提取物（PSP）对大白兔金黄色葡萄球菌性角膜炎的治疗效果。方法：:实验研究。从钝顶螺旋藻干粉中提取PSP，并制备0.01% PSP滴眼液。在45只大白兔右眼角膜中央采用基质注射针基质注射5 μl金黄色葡萄球菌菌液[（ATCC25923，约100个菌落形成单位（CFU）]，构建兔金黄色葡萄球菌性角膜炎模型。角膜基质注射菌液8 h后，将兔随机分成基底对照组、0.9%氯化钠溶液组和PSP组3组，每组15只。0.9%氯化钠溶液组和PSP组分别给予0.9%氯化钠溶液或PSP点眼给药，每15 min点眼1次，持续点眼5次后，改为每30 min点眼1次，持续点眼14次，最后1次点眼后1 h，角膜荧光素钠染色，裂隙灯显微镜下观察兔实验眼角膜上皮缺损情况并给予临床评分，角膜取材后对CFU进行测定；每组随机取3只眼球进行组织病理学观察，采用实时定量PCR检测角膜中炎症因子的表达。组间数据比较采用独立样本 t检验。 结果：:0.9%氯化钠溶液组角膜上皮缺损严重，PSP组角膜上皮缺损较少。与0.9%氯化钠溶液组相比，PSP组临床指标评分明显降低，差异有统计学意义（ t=5.293， P<0.001）。与0.9%氯化钠溶液组相比，PSP组的CFU明显减少，差异有统计学意义（ t=4.383， P<0.001）。组织病理学结果显示0.9%氯化钠溶液组有明显的炎症细胞浸润；PSP组与0.9%氯化钠溶液组相比，眼部结构相对良好，炎细胞浸润较少。实时定量PCR结果显示PSP组角膜组织中炎症因子白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α的表达明显低于0.9%氯化钠溶液组。 结论：:0.01% PSP滴眼液能明显降低金黄色葡萄球菌性角膜炎病变的严重程度和角膜细菌载量，提示PSP对金黄色葡萄球菌性角膜炎可能具有潜在的治疗价值。

目的:建立含有内部阳性对照的支原体荧光PCR检测方法并进行验证，以期用于支原体的快速检测。方法:建立含有内部阳性对照的支原体荧光PCR检测方法并进行专属性、检测限和耐用性评价。应用建立的方法检测发热伴血小板减少综合征毒种是否污染支原体，并与培养法和指示细胞法结果相比较。结果:建立的支原体荧光PCR检测方法特异度好，可以扩增11种含有支原体16S rRNA基因的质粒，扩增效率较高。与生孢梭菌、丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳杆菌、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、白念珠菌、Vero细胞、RD细胞、SF9细胞基因组DNA均无交叉反应。内部阳性对照扩增效率与支原体目的基因扩增效率基本一致，可用于检测是否存在PCR抑制物。检测敏感度高，用7500 Fast实时荧光定量PCR系统可检测到10菌落形成单位(CFU)/ml的发酵支原体，5 CFU/ml的精氨酸支原体、鸡毒支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾原体、口腔支原体、肺炎支原体、滑液支原体，以及1 CFU/ml的螺原体。耐用性好，在每种支原体检测限水平上，不同型号荧光定量PCR仪阳性检出率差异无统计学意义。应用该方法检测发热伴血小板减少综合征毒种为支原体阳性，与培养法和指示细胞法结果一致。结论:本研究建立的含有内部阳性对照的支原体荧光PCR检测方法特异度好、敏感度高、耐用性好，可作为支原体检测的替代方法用于支原体的快速检测。

目的:探究LiaSR双组分信号转导系统对变异链球菌（Sm）593号（Sm 593）临床株耐酸和生物膜形成的影响及相关机制。方法:以Sm 593及其liaS和liaR基因敲除株为研究菌株，采用全自动生长曲线测定仪检测并绘制pH=5.5环境中各菌株的生长曲线；用菌落计数法检测细菌的适应性耐酸能力；使用Laurdan探针、氢-钾腺苷三磷酸（ATP）酶试剂盒、质子通透性检测实验和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）探究LiaSR双组分信号转导系统介导的耐酸机制。体外构建各菌株的生物膜，通过结晶紫染色法、菌落计数法、SYTOX探针检测法和蒽酮-硫酸法探究各菌株的生物膜总量、活菌数、胞外DNA（eDNA）和胞外多糖含量；采用RT-qPCR法检测胞外多糖合成相关基因的表达情况。结果:pH=5.5环境中，liaS和liaR基因敲除株的生长受到显著抑制（ P<0.05）。适应性耐酸曲线显示敲除株与野生株相比，固有耐酸和适应性耐酸能力均显著下降（ P<0.05）。对三菌株无预酸化处理20和40 min以及预酸化处理20和40 min后，liaS基因敲除株生存率［（8.98±2.00）%、（0.18±0.07）%、（14.88±8.64）%、（0.82±0.91）%］和liaR基因敲除株生存率［（0.38±0.19）%、（0.34±0.18）%、（7.89±2.02）%、（1.52±0.37）%］均分别显著低于野生株［（32.49±9.75）%、（1.27±0.32）%、（62.76±29.06）%、（8.02±1.25）%］（均 P<0.05）。此外，liaS和liaR敲除株膜流动性（0.18±0.04和0.18±0.05）均显著低于野生株（0.08±0.05）（均 P<0.01）；不饱和脂肪酸合成基因fabM表达水平（0.52±0.11和0.57±0.05）与野生株（1.04±0.30）相比均显著降低约1/2（均 P<0.001）；H +-ATP酶活性（917.06±59.53和469.53±47.65）与野生株（127.00±50.71）相比显著升高7.22和3.70倍（均 P<0.001），且编码H +-ATP酶基因atpD的表达水平（3.39±0.21和1.94±0.17）也较野生株（1.00±0.15）显著升高3.39和1.94倍（均 P<0.01）。liaR基因敲除株的终末pH值（4.76±0.01）显著低于野生株（4.90±0.00），liaS基因敲除株的终末pH值（5.19±0.01）显著高于野生株（均 P<0.001）。liaS和liaR基因敲除株与野生株相比，Sm 593生物膜总量未发生明显变化，生物膜活菌数均显著少于野生株（均 P<0.05），且eDNA含量均显著高于野生株（均 P<0.01）。liaS基因敲除株生物膜水溶性多糖含量与野生株相比显著增加1.88倍（ P=0.003）。liaS和liaR基因敲除株胞外多糖合成相关基因gtfD表达水平较野生株显著升高47.43和16.90倍（均 P<0.05），liaS基因敲除株中gtfC基因比野生株显著高表达1.65倍（ P=0.014）。 结论:LiaSR双组分信号转导系统通过调控膜不饱和脂肪酸合成和胞膜流动性，参与Sm 593的耐酸过程；LiaR反应调节蛋白还可参与调节膜质子通透性，增强Sm 593的耐酸能力；此双组分信号转导系统可负向调控生物膜胞外基质的产生。

目的:探索牙龈卟啉单胞菌（Pg）持留菌（Ps）对巨噬细胞免疫炎症反应的影响及其作用机制。方法:将Pg（ATCC 33277）悬浮培养和生物膜培养至对数末期（72 h）后，不使用药物处理以及使用高浓度甲硝唑（100 mg/L）和（或）阿莫西林（100 mg/L）处理不同时间，分别为空白对照组、甲硝唑组、阿莫西林组、甲硝唑+阿莫西林组，采用血平板计数法检测Ps生成数量，细菌活死染色检测Ps的生存状态；使用Pg和甲硝唑处理的PgPs（M-PgPs）刺激巨噬细胞，分别为空白对照组（不经任何处理）、Pg组、M-PgPs组；通过透射电镜观察细菌进入细胞内部的情况；使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测巨噬细胞内炎症相关指标的表达情况；通过RT-qPCR检测巨噬细胞叉头盒转录因子1（FOXO1）信号通路的激活情况；利用共聚焦免疫荧光显微镜检测FOXO1在巨噬细胞内的分布情况。使用FOXO1抑制剂（Fi）和激活剂（Fa）处理巨噬细胞后，用Pg和M-PgPs刺激巨噬细胞，分别为空白对照组（不经任何处理）、Pg组、M-PgPs组、Fi组、Fi+Pg组、Fi+M-PgPs组、Fa组、Fa+Pg组和Fa+M-PgPs组，通过RT-qPCR和ELISA法检测巨噬细胞内炎症相关指标的表达情况。结果:悬浮培养和生物膜中的Pg经过高浓度的甲硝唑和（或）阿莫西林处理后，均无法被完全杀灭，且存活的Ps可重新生长形成菌落；Pg和M-PgPs均可进入巨噬细胞内部且巨噬细胞中的炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的蛋白表达量［Pg组分别为（2 392±188）、（162±29）、（5 558±661）、（789±155）μg/L；M-PgPs组分别为（2 415±420）、（155±3）、（5 732±782）、（821± 176）μg/L］均显著高于空白对照组［分别为（485±140）、（21±9）、（2 332±87）、（77±7）μg/L］（均 P<0.01）。同时，Pg和M-PgPs均可促进巨噬细胞内FOXO1入核，巨噬细胞内FOXO1信号通路相关基因FOXO1、B细胞淋巴瘤6和Krüppel样转录因子2 mRNA的相对表达量均显著高于空白对照组（均 P<0.05）。另外，Fi+Pg组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达量［分别为（1 081±168）、（70±8）、（1 976±544）、（420±47）μg/L］均显著低于Pg组［分别为（4 411±137）、（179±6）、（5 161±929）、（934±24）μg/L］（均 P<0.05）；Fi+M-PgPs组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达量［分别为（1 032±237）、（74±10）、（1 861±614）、（405±32）μg/L］均显著低于M-PgPs组［分别为（4 342±314）、（164±17）、（4 438±1 374）、（957±25）μg/L］（均 P<0.05）。相反，Fa+Pg组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白表达量［分别为（8 198±1 825）、（431±28）、（8 919±650）、（2 186±301）μg/L］以及Fa+M-PgPs组蛋白表达量［分别为（8 159±2 627）、（475±26）、（8 995±653）、（2 255±387）μg/L］均显著高于Pg组和M-PgPs组（均 P<0.05）。 结论:PgPs对甲硝唑和阿莫西林表现出高度耐药性；M-PgPs通过上调FOXO1信号通路诱发巨噬细胞的免疫炎症反应，该作用与未经药物处理的Pg无显著差异。

目的:了解山西省家禽中艾伯特埃希菌的带菌情况。方法:采集山西省不同禽类定点屠宰场鸡肠内容物经EC肉汤增菌后，PCR对其进行 eae基因检测，阳性增菌液接种麦康凯琼脂，挑取不发酵乳糖菌落进行三重PCR（ clpX、 lysP和 mdh基因）、16S rRNA基因序列分析及多位点序列分型（Multiocus sequence typing，MLST）鉴定。 结果:本研究共采集了250份样品，经 eae基因检测、生化鉴定、三重PCR检测、16S rRNA及MLST聚类分析，确定2株不发酵乳糖、木糖，无动力， eae、 clpX、 lysP和 mdh基因阳性的菌株为艾伯特埃希菌。进一步对该2株艾伯特埃希菌毒力基因分析发现，该菌株携带Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ组亚型 cdtB基因，但均不携带 stx基因。 结论:本研究表明山西省鸡类中存在艾伯特埃希菌带菌的情况。