目的 探究两歧双歧杆菌BD-1(Bifidobacterium bifidum BD-1,BD-1)以2-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyl-lactose,2'-FL)作为唯一碳源时,与葡萄糖相比,其菌体和代谢产物诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌细胞因子的效应,以探索BD-1菌利用母乳低聚糖后免疫调节的菌株特性.方法 (1)菌体部分干预实验:将BD-1活菌接种于不同碳源的改良MRS肉汤培养基中,改良过的MRS肉汤培养基包括以2％2'-FL作为唯一碳源(2'-FL组)和以2％葡萄糖作为唯一碳源(Glu组)的培养基.将接种后的BD-1活菌在厌氧条件下培养24h后,分离各组菌体和培养基上清液.将菌体部分与RAW264.7细胞共同培养,并以肽聚糖(pep-tidoglycan,PGN)为菌体成分对照,同时设置不添加干预物的阴性对照(Ctrl组).(2)菌体代谢产物部分干预实验:将培养基上清液与RAW264.7细胞共同培养,以含有2％2'-FL或葡萄糖但未进行BD-1菌发酵处理的培养基作为实验对照,并设置不添加干预物的培养基与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阴性对照(Ctrl组),以PGN与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阳性对照(PGN组).培养24h后,提取RAW264.7细胞总RNA,逆转录后采用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、IL-12、IL-1β的基因表达量;收集各组受试物与RAW264.7细胞的共培养上清液,采用酶联免疫吸附试验检测共培养上清液中上述细胞因子的分泌量.结果 (1)菌体部分干预:与PGN组相比,菌体部分2'-FL组和Glu组的TNF-α、IL-6、IL-10分泌量及基因表达量显著上升(均P＜0.05).与Glu组相比,2'-FL组的IL-6、IL-10分泌量显著下降(均P＜0.05),IL-6、IL-10的基因表达具有下降趋势.(2)菌体代谢产物部分干预:BD-1-2'-FL上清组和BD-1-Glu上清组的TNF-α、IL-6及IL-10分泌水平以及基因表达水平较2'-FL组和Glu组(未进行BD-1菌发酵处理的组别)有显著提高(均P＜0.05),而且2'-FL组中IL-6、IL-10的分泌量较Glu组显著增加(均P＜0.05),IL-6表达水平显著升高(均P＜0.05),IL-10表达水平有升高的趋势.2'-FL组相较于Glu组能产生更多的有机酸和种类更为丰富的糖类物质.结论 利用母乳低聚糖或葡萄糖作为唯一碳源培养BD-1菌体和诱导巨噬细胞分泌细胞因子的特征存在差异.当BD-1以母乳低聚糖为唯一碳源时,与葡萄糖相比,菌体成分呈现出抗炎倾向,在巨噬细胞中表现为IL-6的分泌和基因表达能力下降;而其代谢产物则具有刺激免疫激活的趋势,在巨噬细胞中导致IL-6和IL-10的分泌及基因表达能力上升.

目的 选取3种海洋赤潮甲藻为研究对象,从广西涠洲岛海域来源细菌中筛选出高效溶藻的菌株,研究菌株的溶藻效果和初步作用机制,为开展赤潮的防治工作奠定基础.方法 采用细菌发酵液与甲藻共培养来测定菌株的溶藻活性,检测藻细胞中丙二醛和抗氧化相关酶系统的响应规律,分析甲藻胞外溶解性有机物组成,并通过KEGG和CAZy数据库预测目标菌株合成溶藻物质的能力.结果 从24株细菌中筛选到15株对至少一种甲藻表现出溶藻活性的菌株,总阳性率为62.5％,菌株M026对3种甲藻均表现出显著的溶藻效果.添加10％的M026发酵无菌滤液,共培养3d后,3种甲藻细胞死亡率均高达95.0％.生理生化响应表明,在M026发酵无菌滤液胁迫下,甲藻细胞膜脂过氧化损伤严重,3种抗氧化相关酶(SOD、CAT和APX)活性先增加后下降,且三维荧光光谱检测到藻细胞内溶产物为类富里酸和类蛋白类物质.通过全基因组分析,菌株M026含有溶藻活性的次级代谢产物生物合成基因,及多种降解植物细胞壁的酶.结论 菌株M026可作为微生物溶藻菌剂的候选菌株.

含藻人工多细胞体系研究是合成生物学的重要研究内容之一.微藻利用光能,通过光合作用在人工多细胞体系中发挥光能转换的作用.本文综述了含藻人工多细胞体系的构建、形成机制及其在废水处理中的应用.共培养是研究藻-菌相互作用的有效手段,而复杂的生物群落构建还需要进一步的完善.目前已经建立的人工光合多细胞系统包括高效藻类塘、海藻酸盐固定化、藻菌絮体、颗粒污泥和生物膜等.通过高通量测序等手段,可以从上至下地了解体系内微藻和微生物的动态变化.光合人工多细胞体系已经用于废水中有机污染物、抗生素等有害污染物以及重金属脱除.光合人工多细胞体系适配才能形成高效、稳定的系统,可以充分利用代谢互补和代谢协同,并逐步构建结构精准的多细胞体系.本文也展望了含藻人工多细胞体系存在的问题和可能的解决途径.

微藻可以高效利用废水中的部分小分子有机质、氮和磷等污染物合成生物质,并达到处理废水的目的.近年来,利用微藻进行农业废水、工业废水、城市废水和含农药以及抗生素等有害废水的处理等有了一些新的尝试.本文中,笔者重点分析了微藻处理废水中藻种选育、藻菌共培养、藻菌絮体、工艺集成和反应器设计以及可持续综合开发等关键技术问题.其中,藻菌共培养可以发挥微藻和菌的各自优势,提高废水处理效率.藻菌絮体技术还具有便于采收的特点,具备进一步研究的潜力.针对不同废水的处理需求,笔者提出合理构建绿色可持续发展路线,推动微藻处理废水的更广泛应用.

目的 探讨海藻酸钠(Alg)/乙二醇壳聚糖(GC)双网络凝胶材料体外刺激对小鼠调节性T细胞(Treg)免疫功能的影响.方法 制备Alg、GC单网络水凝胶材料及双网络(DN)水凝胶材料(Alg/GC),根据不同水凝胶材料将细胞分为Alg组、GC组、DN组及对照组.采用免疫磁珠分离法分选BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+Treg,应用流式细胞术分析Treg叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)及细胞毒性T细胞相关抗原(CTLA-4)在不同时效(刺激24h或48h)、不同培养环境[有无多黏菌素B(PMB)]下的表达水平,以确定后续细胞培养时间以及是否选用含PMB的培养基;观察Treg与效应T细胞共培养后T细胞增殖活性改变;采用酶联免疫吸附分析(ELISA)技术检测Treg分泌白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β及效应T细胞分泌IL-2、IL-4与干扰素(IFN)-γ的水平.结果 选定实验条件为刺激24h,并使用含PMB的培养基.Alg/GC双网络水凝胶及GC单网络水凝胶作用24h后,与对照组[CTLA-4(47.73±5.35)％,TGF-β(558.75±48.58)pg/ml]比较,CD4+CD25+Treg中CTLA-4的表达水平[DN组(92.21±2.97)％,GC组(95.99±2.79)％]明显升高,TGF-β分泌量[DN组(905.03±73.04)pg/ml,GC组(957.06±138.70)pg/ml]明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),但各刺激组Foxp3表达水平差异无统计学意义(P>0.05).Alg/GC双网络水凝胶及GC单网络水凝胶刺激后,与对照组[(42.04±1.35)％]相比,Treg对效应T细胞增殖活性的抑制作用[DN组(37.22±1.39)％,GC组(35.20±2.03)％]均明显增强,共培养后效应T细胞分泌IL-4/IFN-γ比值[DN组(2.30±0.22),GC组(2.57±0.23)]明显升高,与对照组(1.45±0.27)比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 Alg/GC双网络材料可显著增强Treg介导的免疫抑制功能,其成分中单网络材料GC水凝胶可能发挥了主要作用.

褐藻胶是广泛存在于褐藻中的一类多糖, 降解为褐藻寡糖后能表现出更多的生物活性.从海洋样品中筛选出产褐藻胶裂解酶芽胞细菌16株, 基于形态、生理生化特征和16S r DNA系统发育分析初步鉴定菌株HB12274为解淀粉芽胞杆菌植物亚种 (Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum) .TLC结果显示, 海藻酸钠经粗酶液降解形成2～7聚合度的褐藻寡糖和单糖, 菌株与马尾藻叶片共培养时能明显降解叶状体结构.为褐藻胶裂解酶的生产和工业应用提供了新的菌株来源.

微藻规模化养殖常伴随着细菌的影响,存在于微藻藻际的细菌对微藻生长的影响及藻菌共生的机理尚缺乏深入研究.为建立有益的菌藻共生体系和提高微藻生物质产量,以埃氏小球藻(Chlorella emersonii)为试材,分离藻际微环境的菌群,并运用16S rDNA测序进行鉴定.通过藻菌(1∶1)共培养筛选优势促生菌.人工构建不同比例的菌藻共培养体系,分析优势促生菌对微藻生长和生物质产量的影响.结果 显示,从埃氏小球藻藻株SXND-25藻际分离到6个菌种,属于菠萝泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鹑鸡肠球菌属(Enterococcus gallinarum)和大肠杆菌属(Escherichia coli)四个菌属.其中假单胞菌(Pseudomonas)和菠萝泛菌(Pantoea)为优势促生菌.与其他不同比例菌藻共培养相比,埃氏小球藻与菠萝泛菌1∶5共培养的促生效果突出,埃氏小球藻在第8天生物量达5.86 g/L,藻细胞含油量为26.88％,总油脂产量为1.575 g/L且单不饱和脂肪酸(MUFA)高达554-564mg/L.另一优异组合为埃氏小球藻与假单胞菌1∶1共培养,埃氏小球藻第8天生物量为4.12 g/L,藻细胞含油量达29.50％,总油脂产量提高到1.215g/L,但MUFA含量低(168-175 mg/L).研究表明在埃氏小球藻培养过程中,适量添加促生菌,可同时提高埃氏小球藻生物质和油脂产量,这为探究藻菌互作效应以及有益藻菌共生体系应用于微藻规模化生产提供参考依据.

微藻油脂不仅可以作为功能油脂,同时也是生产生物柴油的重要原料之一.为解决微藻生长与油脂积累之间的矛盾,利用藻菌共培养技术在缺氮条件下将无菌小球藻与细菌以不同初始比例进行共培养,通过测定藻细胞生物量、油脂含量和脂肪酸比例等来研究藻菌共培养对小球藻生长和油脂积累的影响.结果 表明,在小球藻与固氮菌B2.3 70∶1 (V/V)共培养体系中,小球藻的生物量和油脂含量较同样条件下单独培养小球藻有了显著提高.其生物量最高可达1.68g/L、总脂含量为45.2％、总脂产率为75.94 mg/(L· d)、中性脂含量为23.0％及中性脂产率为38.65mg/(L·d),其生物量和油脂含量分别较单独小球藻培养时提高了66.3％和47.7％.同时细菌的加入显著提高了藻细胞内C18∶1脂肪酸的比例.结论 表明,通过藻菌共培养技术能够有效提高微藻生物油脂的质量和产量,具有较好的实际利用价值.

为提高藻菌共培养体系对养殖废水的处理效果,优选最佳的共培养方式和处理时间,研究普通小球藻(UTEX2714)和活性污泥在5种共培养体系中对污染物的去除效率[游离小球藻和游离活性污泥(Sc+Sa),游离小球藻和固定化活性污泥(Sc+ Ia),游离活性污泥和固定化小球藻(Sa+ Ic),固定化小球藻和固定化活性污泥(Ic+ Ia),藻菌共固定[I(c+a)](藻菌:小球藻和活性污泥),考察体系的稳定性和胶球的可重复利用性.结果显示:游离活性污泥和固定化小球藻共培养体系在48 h对养殖废水的处理效果最佳,对氨氮(NH4+-N)、总氮(TN)、总磷(TP)、化学需氧量(COD)的去除率分别为93.89％、91.95％、97.53％、93.41％;细胞比增长速率0.214/h,均大于其他4组共培养体系.稳定性试验中胶球在使用一个周期(48h)后用CaCl2再次加固可提高系统的稳定性,可稳定运行8个周期,NH4+-N、TP的去除率分别在81.59％-93.69％、84.23％-98.74％.本研究表明Sa+ Ic共培养体系运行48 h能有效处理养殖废水;稳定性试验中,加固方法能有效保证系统稳定运行;结果可为藻菌共培养体系处理水产养殖废水的实际应用提供基础数据.

从斜生栅藻藻际分离共生菌群并进行16S rDNA序列鉴定,构建藻菌共培养体系,并检测斜生栅藻生长、生理生化及产油特性.共分离出7个菌群/株,包括微球菌(菌株1-1、1-2和1-3)、假单胞菌(菌株2-1和2-2)、微小杆菌(菌株-3)和葡萄球菌(菌株-4).微球菌(菌株1-2)和假单胞菌(菌株2-1)为优势促生菌株,能显著促进微藻生长及色素和油脂积累.斜生栅藻与微球菌(菌株1-2)1∶10共培养体系培养8d后,栅藻生物量高达4.27 g·L-1,比对照增加了46.0％;叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别比对照提高12.1％、16.7％和25.0％;含油量为25.7％,比对照增加了14.0％,单不饱和油酸含量(16.4％)也显著高于对照.另一个优异共培养体系是斜生栅藻与假单胞菌(菌株2-1)1∶5共培养体系,在培养8d后,微藻生物量、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别比对照提高47.9％、16.0％、17.5％和19.9％;总油脂(27.1％)和单不饱和油酸含量(18.2％)分别比对照增加了20.4％和64.0％.表明藻际共生菌假单胞菌和微球菌可分别与斜生栅藻互作,能够显著促进斜生栅藻生物量和优质油脂的富集,可应用于栅藻商业生产.