二十二碳六烯酸(DHA)作为人体必需的多不饱和脂肪酸,在维护心血管健康、抗癌、支持视觉和脑功能等方面至关重要.传统的深海鱼油提取DHA方法存在鱼腥味重、工艺繁琐等问题,迫使研究者寻求更为高效、环保的替代方案.破囊壶菌(Thraustochytrids)凭借其生长迅速、低重金属污染以及高DHA含量的特性,成为工业化生产DHA的潜力微生物之一.当前在破囊壶菌发酵生产DHA的过程中,依然需要解决一系列关键问题,包括提高发酵产量、降低成本等.本文旨在全面阐述破囊壶菌发酵生产DHA的研究现状,包括菌株筛选与改良、DHA生物合成途径、遗传转化及代谢工程、发酵控制策略等方面.首先,总结归纳了对野生型菌株的自然筛选和诱变改良等方法,不断提高破囊壶菌中DHA产油量.其次,详细介绍了破囊壶菌DHA合成途径的研究进展,着重分析了生物合成途径中关键辅助因子在DHA生产中的作用.此外,概述了外源DNA传递到破囊壶菌细胞的遗传转化技术的应用现状,为提高其遗传转化效率和稳定性提供重要参考.在DHA代谢调控方面,探讨了氮限制对DHA合成的促进作用以及温度和氧气供应对生产效率的影响.最后,对利用破囊壶菌生产DHA存在的主要瓶颈问题和未来发展趋势进行了总结,以推动其在医药、保健品和食品等领域的广泛应用,实现工业规模下的高效生产.

以丝状产油微藻段殖黄线藻(Xanthonema hormidioides)作为实验材料,经过低温(5℃)预处理后的藻种与常温(25℃)条件下的藻种进行对比实验,研究段殖黄线藻在不同温度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃)和高、低氮浓度(18和3 mmol/L)条件下的生长和油脂积累及低温(5℃)对这两种状态下的藻种光合活性和抗氧化酶系统的影响.结果显示:低温预处理后的段殖黄线藻在各温度下积累的生物量要高于常温条件下的段殖黄线藻,在15℃时可达到最高生物量为10.1 g/L,20℃条件下可获得最高油脂和脂肪酸绝对含量,分别占干重的64.20％和49.05％(3 mmol/L),蛋白质含量在15℃时达到最高为43.5％(18 mmol/L),总碳水化合物则基本维持在10％-25％.5℃下段殖黄线藻对光的利用率(a)及最大电子传递速率(ETRmax)均受到明显抑制,低温预处理后的段殖黄线藻叶绿素a含量、Fv/Fm和Fv/Fo值均在第9天后超过常温实验组,最高分别可达9.98 mg/g、2.99和0.75(3 mmol/L).与常温实验组相反,低温预处理后段殖黄线藻在5℃下ETRmax和对强光的耐受能力(IK)均有所升高.此外,低温预处理后段殖黄线藻超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的最大活性可达65.6和0.56 U/mg protein,均显著高于常温段殖黄线藻(P＜0.05).综上,低温预处理后的段殖黄线藻生长和代谢产物的积累更具优势,并且在低温适应性、光合效率及抗氧化应激方面的能力也得到显著提升.

为探究光合细菌对桡足类生长和生殖的影响,研究不同微藻饵料对安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus an-nandalei)发育和繁殖的影响,结果显示,不同种类的饵料微藻对安氏伪镖水蚤的发育和繁殖影响效果显著(P<0.05),投喂湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)时,水蚤的发育最快,存活率最高,总产幼体数最高.在湛江等鞭金藻饵料中添加不同浓度光合细菌,结果显示,在投喂等量微藻的条件下,当添加的光合细菌浓度达到 1 mgC/L时,其无节幼体和桡足幼体的发育时间分别缩短 20%和 14.5%,个体存活率提高 21.7%,总产幼体提高 20.4%.而当添加菌浓度为 2 mgC/L时会显著抑制其发育和繁殖.结果表明,在微藻饵料中添加适量光合细菌有利于安氏伪镖水蚤的发育和繁殖.

研究从生物可利用性角度出发,筛选出2个高效且特异响应氮、磷生物可利用度的聚球藻启动子,驱动细菌荧光素酶报告基因,构建了用于直接检测环境样品中营养盐生物可利用度的微藻细胞生物报告器,获得了生物发光与标准氮(NO3-)、磷(PO43-)营养盐浓度的关系曲线,可用于水体氮、磷生物可利用度的快速检测.同时,使用国标法与本方法对南海航次水样进行了测定,国标法测得的磷浓度为0.17-3.00 μmol/L,氮浓度为1.04-49.34 μmol/L,而本方法测定的磷浓度为0.10-1.13 μmol/L,与国标法测定的结果接近;氮浓度为32.57-98.06 μmol/L,比国标法测得的浓度高,可能是由于水样中还含有其他形式的氮.研究提出了利用生物报告器检测并量化海水氮、磷生物可利用性的方法,是对水体营养盐化学浓度指标的重要补充,为环境样品营养盐生物可利用性检测提供了新的方向和思路.

经济成本过高阻碍了微藻产品的产业化,而国内目前缺乏有关微藻产品技术经济分析的研究.为探究更符合我国国情的降低微藻产品成本的策略,本文采用结合地域气候和藻种特性的微藻生长模型,对基于管道式光生物反应器的藻粉(含水量为 5%的微藻生物质)生产过程进行技术经济分析,讨论了价格和工艺两大类共 12 个参数以及生产规模对藻粉总成本的影响程度,并对影响经济成本的主要参数进行情景设计.结果显示,普通小球藻(Chlorella vulgaris)藻粉产量受地域和季节影响较大,对位于浙江省乐清市规模为 0.1 hm2的生产基地,藻粉年产量约3.8 t,成本为 185.7 ￥/kg.直接人工费、生长温度、光合效率和年运行时间是影响藻粉总成本的四个重要参数,最具成本吸引力的产业化规模约为 10 hm2.考虑了降价空间和技术进步的某未来情景下藻粉成本可降至 22.6 ￥/kg,该值与近年来文献给出的亚洲西南部和欧洲各地商业规模的微藻干物质成本较为接近.本文的研究可为我国微藻产品产业化的发展提供一定的理论和数据参考.

含藻人工多细胞体系研究是合成生物学的重要研究内容之一.微藻利用光能,通过光合作用在人工多细胞体系中发挥光能转换的作用.本文综述了含藻人工多细胞体系的构建、形成机制及其在废水处理中的应用.共培养是研究藻-菌相互作用的有效手段,而复杂的生物群落构建还需要进一步的完善.目前已经建立的人工光合多细胞系统包括高效藻类塘、海藻酸盐固定化、藻菌絮体、颗粒污泥和生物膜等.通过高通量测序等手段,可以从上至下地了解体系内微藻和微生物的动态变化.光合人工多细胞体系已经用于废水中有机污染物、抗生素等有害污染物以及重金属脱除.光合人工多细胞体系适配才能形成高效、稳定的系统,可以充分利用代谢互补和代谢协同,并逐步构建结构精准的多细胞体系.本文也展望了含藻人工多细胞体系存在的问题和可能的解决途径.

以小球藻FACHB-1580和栅藻FACHB-1618为研究对象,比较了两株绿藻在0.04％CO2、5％CO2和20％CO2(v/v)三种通气培养条件下的生长和生理特性的响应,试图阐述与无机碳利用相关生理参数和微藻利用CO2能力的关系.结果表明,两株绿藻均能高效利用CO2,在5％(v/v)条件下均表现出最大生物量积累、最大比生长速率和最大二氧化碳固定速率.小球藻FACHB-1580和栅藻FACHB-1618最大生物量分别为3.5和5.4 g/L,分别是0.04％CO2(v/v)条件的1.41和1.46倍.在高达20％CO2(v/v)条件下,两株绿藻的生物量均显著高于空气组(P<0.05).随着CO2浓度的增加,两株绿藻的无机碳亲和力、胞内和胞外CA活性、初始Rubisco活性,及Rubisco活化度均有下降趋势,总的Rubisco活性变化不明显.另外,小球藻FACHB-1580存在较高的胞外和胞内CA活性;而栅藻FACHB-1618胞外CA活性几乎为零,胞内CA活性显著低于小球藻FACHB-1580.由此推测,小球藻FACHB-1580能同时吸收介质中的和CO2,其胞内CA催化胞内快速转化为CO2,从而为Rubisco提供充足的CO2来源;而栅藻FACHB-1618主要吸收介质中的CO2,其胞内CA活性较低,推测其通过提高胞内CA含量,或增强Rubisco对CO2的亲和力等促进光合固碳作用.

以从新疆富蕴县金属矿区土壤筛选出的抗重金属微藻F1为材料,测定在不同浓度(0、0.5、1.0、1.5和2.0mmol/L)Cu2+胁迫下F1微藻叶绿素a、可溶性蛋白、MDA和谷胱甘肽(GSH)含量,以及谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)和谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCL)的活性,同时用红外光谱仪检测细胞壁上参与重金属螯合的官能团,用扫描电镜分析细胞壁上的离子交换情况,探讨F1土壤微藻对CR2胁迫的耐受生理机制,为利用微藻生态修复技术去除污染区土壤重金属奠定基础.结果显示:(1)F1土壤微藻对Cu2+具有较强的耐抗性.(2)F1土壤微藻细胞中参与吸附Cu2的基团分别为-OH、-CH2、-RCONH2和C-OH等.(3)F1土壤微藻在吸附Cu2+的过程中,Cu2 +与细胞壁上的Al3+、Fe2+、Mg2+、Ca2 +、K+、Na+和Zn2+发生了交换.(4)藻细胞中的GSH和GSH-PX在F1土壤微藻耐受Cu2+胁迫时起主要作用.研究认为,F1微藻种对Cu2+的耐受性首先与其细胞壁外表细微结构及其离子交换特性有关,并且细胞壁上-OH、-CH2、-RCONH2和C-OH等化学基团起着重要作用,其次细胞内的谷胱甘肽以及谷胱甘肽相关酶类能够有效清除活性氧的过量积累,最终保护细胞免受重金属胁迫损伤.

微藻是生产生物柴油理想的生物资源,对产油微藻的生理生化特性的研究具有重要意义.本文以一种耐碱性产油微藻集球藻为研究对象,将其置于两种光强水平(100和600μmol photons·m-2·s-1)下培养,探讨缺氮对集球藻光合生理及油脂积累的影响.结果表明:缺氮培养下,集球藻光系统Ⅱ的最大光化学效率Fv/Fm下降,电子从QA-到QB的电子传递受阻,光合作用受到抑制,生长表现缓慢,蛋白质含量降低,而油脂含量增加;在高光的耦合作用下,其光合作用进一步受到抑制,蛋白质含量下降,但油脂含量与低光缺氮条件下相比,没有显著变化.研究表明,缺氮使集球藻碳同化进入油脂合成代谢,增加其油脂含量,而光强对油脂积累的诱导效应不明显.

东海原甲藻是常见有毒有害赤潮藻.本文从种群生长、光合效率和抗氧化系统等角度研究大型海藻分泌物亚麻酸胁迫下东海原甲藻的生理生化响应.结果表明:低浓度亚麻酸(＜200 μg·L-1)对东海原甲藻的生长具有促进作用,200～1000 μg·L-1浓度下,东海原甲藻的生长受到显著抑制,当亚麻酸浓度为1000 μg·L-1时,抑藻率达90％;200 ～ 1000μg·L-1亚麻酸胁迫下,藻细胞光合色素含量显著降低,最大光能转化效率Fv/Fm降低,当亚麻酸浓度为1000 μg·L-1时,Fv/Fm为对照组的33.87％;随着亚麻酸浓度的增大,抗氧化酶活性(过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GPx)与抗氧化非酶物质(还原型谷胱甘肽GSH、氧化型谷胱甘肽GSSG、抗坏血酸AsA和脱氢抗坏血酸DHA)含量呈现出先升高后降低趋势;亚麻酸胁迫下丙二醛含量显著升高,表明膜脂过氧化程度加剧.以上结果说明,低浓度亚麻酸对东海原甲藻的生长具有促进作用,高浓度亚麻酸主要通过降低光合效率和细胞过氧化损害抑制东海原甲藻的生长.研究结果为生物法防控以东海原甲藻为优势藻种的赤潮提供了理论基础.