为研究贵州天麻主产区蜜环菌的生物种及其遗传多样性,在贵州天麻主产区采集蜜环菌样本,利用双抗培养基分离菌索或子实体、菌材,定期观察并统计蜜环菌母种及原种的生物学特性;挑取菌索提取总DNA,利用真菌通用引物 ITS和延伸因子 EF1-α基因扩增 rDNA-ITS、rDNA-EF1-α片段并送测序及鉴定;用DNAStar软件进行GC含量分析及多序列比对,用MEGA软件构建进化树.从贵州毕节各县区、黔东南州雷山县等分离到17 株蜜环菌,并与生产上普遍用的A9、京234 做比较,通过生物学特性初步分析各蜜环菌的形态差异;通过rDNA-ITS、rDNA-EF1-α扩增,得到19 株菌株的rDNA-ITS、rDNA-EF1-α完整序列,经GC含量分析、多序列比对、BLAST比对鉴定以及系统发育分析,将19 株菌株分为3 个种.通过对蜜环菌菌株生物学特性及rDNA-ITS、rDNA-EF1-α序列分析,发现贵州天麻主产区蜜环菌野生资源主要为Armillaria sp.,其次为Armillar-ia mellea、Armillaria gallica.

目的 采用层次分析(AHP)-熵权法综合评价天麻共生蜜环菌质量.方法 将采集到的6株天麻共生蜜环菌菌株的生理、生长、化学指标作为评价因子,通过AHP-熵权法计算各指标权重系数,构建综合质量评价体系,对蜜环菌菌株进行质量评估,并通过红天麻、杂交天麻伴播试验进行验证.结果 质量评价结果显示,胞外木聚糖酶活性、胞外纤维素酶活性、总糖含量权重较大,其中菌株N6、N3排名靠前.不同变型天麻伴播试验显示,菌株N5、N4伴播红天麻效果较好,菌株N6、N3伴播杂交天麻效果较好.结论 蜜环菌的胞外木聚糖酶活性、纤维素酶活性和总糖含量等指标与伴播天麻的效果相关性较强.本研究构建的质量评价体系与杂交天麻伴播试验结果基本一致,可为天麻优良共生蜜环菌的筛选提供参考.

天麻种苗的存活率、产量、单重与土壤相对含水量(RWC)及天麻共生蜜环菌的生长特性密不可分,研究土壤RWC对蜜环菌菌株生长特性及乌天麻种苗的影响,可为乌天麻良种繁育及乌天麻共生蜜环菌优良菌株筛选提供指导.该研究根据30 株蜜环菌菌株在活化培养基上的生长特性将其分为 4 类,再从每类蜜环菌菌株中筛选 2 株生长特性指标优的菌株与乌天麻米麻及阔叶树修剪枝进行箱式控水熟料栽培试验.结果发现具有根状菌索单轴分枝的蜜环菌菌株是与乌天麻共生的优良菌株,如第Ⅲ类、第Ⅳ类蜜环菌;土壤RWC对不同类型蜜环菌的生长特性指标,乌天麻种苗的存活率、产量、单重有显著影响;土壤RWC为 75%时,蜜环菌菌株生长速度、直径、分支数、生物量及乌天麻种苗存活率、产量、单重均最优,通过人为控制土壤的RWC,在大棚内将乌天麻米麻与优良蜜环菌菌株及阔叶树修剪枝伴栽可以获得优良的乌天麻种苗,为乌天麻的高效生产、米麻利用提供参考.

目的:优化蜜环菌菌株M6的发酵工艺及提高其生产效率.方法:以蜜环菌菌株M6为供试菌株,通过摇瓶液体培养,筛选该菌株的最适液体发酵培养基;以摇瓶培养结果为基础,通过多级匀浆制备高活性种子液,进行液体深层发酵,优化发酵条件.结果:筛选出蜜环菌菌株M6最佳液体深层发酵条件为转速150 r/min、接种量5％、溶氧20％及温度28 ℃,在此条件下使用液体发酵培养基配方1发酵180 h所得蜜环菌菌株M6生物量干重高达18.39 g/L;使用液体发酵培养基2发酵120 h所得蜜环菌菌株M6生物量干重达23.83 g/L.结论:液体培养条件优化后,蜜环菌菌株M6生物量产出较高.本研究促进了蜜环菌菌株M6的快速生产,为应用于天麻种植业提供了技术参考.

为了揭示我国不同蜜环菌Armillaria 的木腐特性,本研究以我国 8 个蜜环菌种为材料,采用蜜环菌液接种 1 cm3 的枹栎Quercus serrata木方,置于 23℃下培养 60 d和 120 d,采用重量法、Klason法、硫酸水解法和盐酸水解法测定木材质量、纤维素含量、木质素含量和半纤维素含量,研究各蜜环菌株的木腐能力及差异性.结果表明,各蜜环菌种对枹栎木质量损失率排序为:CBS M(A.borealis)>CBS A(A.sinapina)=CBS J(A.qinii)=CBS H(A.bruneocystidia)=CBS F(A.sinensis)=CBS B(A.gallica)>CBS N(A.violacea)=CBS D(A.ostoyae);木质素的分解能力排序为:CBS M=CBS A=CBS J>CBS H=CBS B=CBS F>CBS N>CBS D;纤维素降解利用率排序为CBS H=CBS A>CBS B>CBS J>CBS F>CBS D>CBS M>CBS N;半纤维素分解能力排序为:CBS M>CBS J>CBS H=CBS A=CBS F=CBS N>CBS B>CBS D;木质纤维素总量消耗排序为:CBS H>CBS A>CBS J>CBS B>CBS F>CBS M>CBS D>CBS N.我国主要蜜环菌的木腐能力在木腐真菌类群中处于中等以下水平.在蜜环菌属内,各菌种之间腐朽能力的多样性表现为对凋落物不同组成降解能力存在显著的差异和腐朽类型的可变性,其形成的原因可能与其适应森林生态系统物种多样性有关.本研究可为理解森林生态系统中凋落物的降解和碳循环的机理提供部分理论指导,同时为我国天麻栽培蜜环菌选育提供参考.

目的:探究低温胁迫对不同蜜环菌生长的影响,为高海拔地区天麻种植选育耐低温的优良蜜环菌菌株提供科学依据.方法:以不同天麻产区的 24 株蜜环菌为实验材料,采用rDNA-基因间隔区(IGS)序列进行分析鉴定,确定供试菌株的亲缘关系;以 23℃为对照(CK)、15℃为低温胁迫,利用赋值法综合评价各菌株生长速率、生物量、菌索长度,筛选耐低温的优良菌株,采用蒽酮硫酸法检测可溶性糖含量,利用SPSS 26.0 分析低温胁迫可溶性糖含量与生长特性的相关性.结果:24 株蜜环菌均与高卢蜜环菌Armillaria gallica亲缘关系较相近.低温胁迫后,各菌株的生物量、菌索长度、生长速率均受到不同程度的抑制,根据赋值法综合评价,有 4 株菌株的耐低温能力较强、可溶性糖含量均增加,而对于低温较为敏感的菌株可溶性糖含量均降低.相关性分析结果表明,可溶性糖含量与生物量、菌索长度、生长速率呈强正相关.结论:高卢蜜环菌为天麻生产中常用伴生菌种,YN4、GZ7、GZ17、SX2 菌株的耐低温能力较强,推测蜜环菌通过累积可溶性糖抵御低温胁迫.

本论文以蜜环菌属(Armillaria mellea)真菌CPCC 400891为研究对象,基因组挖掘分析发现该菌株基因组中含有18个倍半萜合成酶编码基因,但其功能却鲜有报道.采用色氨酸营养缺陷型表达载体pYET,并以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ5464为宿主菌分别表达蜜环菌来源的18个倍半萜合成酶编码基因(Arm_STS1-Arm_STS16).结合气相色谱—质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析平台,对构建的重组菌(BJ-Arm_STS1-BJ-Arm_STS16)发酵产物进行采集分析.结果显示,蜜环菌CPCC 400891来源的12个倍半萜合成酶归属于新的类群:亚家族Ⅳ.同时,10个倍半萜合成酶在酿酒酵母中确定表达.根据美国国家标准与技术研究院(NIST)的标准参考数据库(https://webbook.nist.gov/)检索比对,共鉴定17个倍半萜(醇)分子,包括α-雪松烯、β-雪松烯、罗汉柏烯、杜松萜烯、β-花柏烯和毕橙茄醇等.GC-MS检测分析发现,亚家族Ⅳ类群倍半萜合成酶均能合成多个(种)倍半萜分子.综上所述,本研究为后续改造并优化特定倍半萜合成酶,从而为深入开展STSs的催化机制研究奠定基础,也为从蘑菇类大型真菌中发现更多新颖的倍半萜合成酶提供依据和思考.

蜜环菌能为药用真菌伞形多孔菌菌核(猪苓)的生长提供营养,其自身也是一种重要的食药用真菌.筛选优良的蜜环菌菌株既可用于猪苓的栽培生产,也可为蜜环菌的进一步开发提供参考.本研究将从野生猪苓中分离得到的47株蜜环菌菌株划分形态型,选取12个代表性菌株进行液体培养,研究菌丝体多糖含量,以及发酵液中的羧甲基纤维素酶(CMC酶)、木聚糖酶、漆酶的活性变化.结果显示,蜜环菌菌株M8-3生长较快,生物量累积最高,3种关键酶的活性也较高,为较优质菌株,可用于猪苓的栽培实验;菌株M3和M8-3菌丝体多糖含量较高,可作为蜜环菌开发利用的候选菌株.

目的:利用农杆菌介导法,建立蜜环菌的遗传转化体系,为分子学研究奠定基础.方法:将含有EGFP的表达载体转入农杆菌EHA105中,构建农杆菌工程菌.把成熟的蜜环菌菌索剪断并浸泡在农杆菌中,在乙酰丁香酮的作用下,农杆菌工程菌将EGFP基因整合到蜜环菌基因组中.利用PCR法和荧光观察法筛选并检测蜜环菌菌株的转化情况.结果:转化成功的蜜环菌其基因组中含有EGFP基因,并且其后代遗传稳定,通过荧光显微镜能够检测到绿色的荧光点.结论:农杆菌介导的蜜环菌遗传转化体系是一种效率较高,简便快速的转化方法,能够将目的基因转入到蜜环菌中并成功表达.

蜜环菌属Armillaria真菌是世界范围内广泛分布的担子菌,既是引起森林病害的重要病原菌,也是天麻和猪苓生长的必须共生真菌,具有重要的经济价值.本文对我国鄂西天麻主产区即神农架林区、大老岭自然保护区、宜昌市所属的夷陵区和五峰县、恩施自治州等地进行了系统的调查采样,共获得45份蜜环菌子实体样本及其二倍体菌株,其中通过孢子印分离获得约320个单孢菌株.在此基础上,采用IGS、ITS和elongation factor-1 alpha(EF1-α)分子标记对45份二倍体菌株进行测序和系统发育分析,对有单孢株的样本采用遗传互交不育性实验进行生物种鉴定.结果 表明,鄂西地区的蜜环菌分为4个clade,共有6个不同的蜜环菌生物种,分别为CBS J,CBS L,CBS N,CBS O,CBS F和Armillaria mellea,具有丰富的遗传多样性.其中,24个样本鉴定为CBS L,是鄂西地区的优势种;9个样本鉴定为CBS J;9个样本鉴定为CBS N;另有3个样本分别鉴定为CBS O,CBS F和Armillaria mellea.其中CBS L、CBS N、CBS O首次在湖北地区报道,扩大了这3个生物种的分布范围.本研究为了解鄂西地区蜜环菌的资源情况提供基础数据,对天麻生产蜜环菌菌种选育具有重要的参考价值.