为了克隆努比亚山羊(Capra nubiana)同源异形盒转录因子1(prospero-related homeobox protein 1,PROX1)基因和检测过表达PROX1基因对努比亚山羊骨骼肌成肌细胞分化和肌纤维类型转化相关基因mRNA表达的影响,为研究PROX1基因在骨骼肌发育中的调控作用提供参考,本研究以努比亚山羊背最长肌组织cDNA为模板克隆PROX1基因,构建pEGFP-N1-PROX1真核表达载体,转染至努比亚山羊骨骼肌成肌细胞,24 h后更换分化培养基,收集分化6 d的细胞,通过RT-qPCR检测过表达PROX1基因后细胞分化标志基因、NOTCH信号通路相关基因以及骨骼肌肌纤维类型相关基因的表达情况.研究结果表明努比亚山羊PROX1基因编码区(coding sequence,CDS)序列长度为2 214 bp,编码含737个氨基酸的多肽.RT-qPCR结果表明PROX1基因可以通过抑制NOTCH信号通路,上调细胞分化标志基因表达水平进而促进成肌细胞的分化(P＜0.05),并介导CaN/NFAT信号通路,显著下调MYH2和MYH4基因的mRNA表达水平(P＜0.05).本研究初步确定努比亚山羊PROX1基因参与调控骨骼肌成肌细胞的分化和肌纤维类型的转化,研究结果为进一步丰富肌肉生长发育的分子机制提供理论数据.

葡萄牙假丝酵母菌性阴道炎在临床较为罕见,本文报道1例由葡萄牙假丝酵母菌(Candida lusitaniae,CL)引起外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)的患者.本例患者为40岁女性,主要临床表现为月经前外阴瘙痒、白带增多、反复半年.将患者阴道分泌物直接涂片分别进行免疫荧光染色、革兰染色、瑞氏染色,镜检找到真菌孢子,CHROMagar显色平板鉴定为光滑假丝酵母菌,梅里埃VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统鉴定为CL.该病例的诊治过程提示,CL实验室诊断易与其他假丝酵母菌混淆,为防止漏报或错报,对于难治病例需要考虑少见菌株感染可能.

目的 通过超声刺激脂肪间充质干细胞后,收集其分泌的细胞外囊泡,与正常脂肪间充质干细胞分泌的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)进行比较,探究经超声刺激后分泌的细胞外囊泡对脂肪间充质干细胞生物学特性(包括细胞增殖、细胞迁移和成脂分化能力)的影响.方法 首先,通过低强度超声处理部分脂肪间充质干细胞,收集细胞培养上清并采用超滤法提取细胞外囊泡(U-EVs),部分间充质干细胞正常培养,并收集其细胞外囊泡(N-EVs).在不同浓度细胞外囊泡处理下对脂肪间充质干细胞进行CCK-8实验检测细胞活力,选取提升细胞活力的最佳浓度,在这一浓度下采用划痕实验检测细胞迁移,EdU法检测细胞增殖,并使用成脂诱导培养基诱导并比较脂肪间充质干细胞成脂分化能力.结果 超声刺激后产生的细胞外囊泡符合国际外囊泡协会的鉴定标准,对脂肪间充质干细胞作用的最适浓度约为150 μg/mL.在这一浓度下,U-EVs的细胞增殖率(19.2%±1.8%)显著高于N-EVs(11.9%±3.4%),并且U-EVs组的油红O染色面积是对照组的(2.78±0.23)倍,显著高于N-EVs组的(2.11±0.18)倍,但N-EVs组(16.3%±2.0%)和U-EVs组(21.5%±2.3%)的细胞迁移率没有显著差异.结论 经超声刺激的脂肪间充质干细胞分泌的细胞外囊泡显著促进脂肪间充质干细胞的活力,提高细胞增殖、迁移和成脂分化的能力.

目的 探讨黄芪含药血清对自然杀伤(NK)细胞的杀伤活性和NKG2D、NKG2A、细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)表达水平的影响.方法 20只SPF级SD大鼠,随机分成黄芪低、中、高剂量组(3.1、6.2、12.4 g/kg体重)和正常对照组,灌胃后制备含药血清.用NK细胞专用培养基培养NK-92MI细胞,用1640培养基培养YAC-1细胞.将NK-92MI细胞与20％不同剂量黄芪含药血清及正常对照血清孵育48 h,即分别为正常对照组、黄芪低剂量组、黄芪中剂量组以及黄芪高剂量组.通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定方法检测NK细胞对靶细胞YAC-1的杀伤活性,ELISA法检测IFN-γ的水平,Western blot检测NKG2D以及NKG2A蛋白表达水平.结果 与正常对照组和黄芪低剂量组相比,黄芪中、高剂量组的NK细胞活性显著升高(P＜0.01).IFN-γ的表达在黄芪低、中、高剂量组中均升高,但不随浓度升高而增强.与正常对照组相比,黄芪低、中剂量组NKG2D蛋白表达水平明显升高(P＜0.01),而NKG2A蛋白表达水平在各组间无明显差异(P＞0.05).结论 黄芪含药血清可增强NK细胞杀伤活性、上调IFN-γ表达水平、上调NK细胞活化型受体的表达,通过调控NK细胞实现对机体的保护作用.

目的:探讨肿瘤内皮细胞(TECs)来源CXC趋化因子配体8(CXCL8)在肝细胞癌(HCC)血管生成拟态(VM)中的作用。方法:收集2018年9月到2019年9月在北京朝阳医院行手术切除的HCC组织，免疫磁珠法分离TECs；慢病毒感染TECs，敲低其CXCL8表达，分为对照组和敲低组，收集其条件培养基；酶联免疫吸附试验检测TECs条件培养基中CXCL8的表达；小管形成实验观察HCC细胞VM；蛋白质印迹法观察HCC细胞中相关蛋白水平变化。组间比较采用独立样本 t检验或单因素方差分析。 结果:TECs敲低组中CXCL8蛋白表达水平较对照组明显降低。对照组条件培养基中CXCL8水平[(1 076.00±88.80) pg/ml]较敲低组明显升高[(787.50±63.43) pg/ml]，差异有统计学意义( t＝5.920， P<0.01)。对照组和敲低组条件培养基处理HepG2细胞后相对小管长度分别为(9 814.0±692.8)和(6 434.0±1272.0)，差异有统计学意义( t＝4.042， P<0.05)；在SMMC7721细胞中，对照组和敲低组分别为(22 317.0±3 121.0)和(9 834.0±1 534.0)，差异有统计学意义( t＝6.217， P<0.01)。CXC趋化因子受体1(CXCR1)中和性抗体预处理HCC细胞后，TECs促进HCC细胞的VM能力减弱。对照组条件培养基较敲低组明显促进HCC细胞中波形蛋白(Vimentin)和Snail的表达。HepG2细胞中Vimentin的表达量为0.178±0.020和0.094±0.023( t＝4.707， P<0.01)，Snail的表达量为0.273±0.020和0.188±0.033( t＝3.755， P<0.05)；SMMC7721细胞中Vimentin的表达量为0.342±0.020和0.242±0.035( t＝4.270， P<0.05)，Snail的表达量为0.189±0.014和0.139±0.021( t＝3.354， P<0.05)。 结论:TECs通过旁分泌CXCL8方式结合HCC细胞表面CXCR1，调节上皮-间充质转化(EMT)来促进HCC细胞VM。

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是起源于人体各种组织，如骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、牙髓的一类多能干细胞 [1]。MSCs的分泌组包括MSCs条件培养基、各种旁分泌/自分泌因子等以及称为细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的小泡分泌物 [2]。与MSCs一样，MSCs-EVs作为一种重要的信号传导介质，可以有效转运各种miRNAs、LncRNAs和蛋白质等至靶细胞内 [3,4]，发挥着炎症-免疫调节、抗凋亡、调控靶细胞的组织再生修复等作用，在脓毒症、创伤等急危重症中得到一定应用 [5,6]。

旨在探讨哌立福新对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及其作用机制。本研究通过24孔板静置孵育24 h培养铜绿假单胞菌生物膜，再通过结晶紫染色法检测哌立福新对铜绿假单胞菌培养基底部生物膜的抑制作用，将未加哌立福新的孔设置为对照组；通过玻璃试管静置孵育24 h构建气-液交界面生物膜，并通过结晶紫染色法检测哌立福新对铜绿假单胞菌气-液交界面生物膜形成的影响，将未加哌立福新的孔设置为对照组；将铜绿假单胞菌重悬于含有系列浓度的哌立福新培养基中，置于恒温摇床，连续检测其生长浊度随时间的变化，绘制时间-生长曲线，检测哌立福新对铜绿假单胞菌浮游菌增殖的影响，将未加哌立福新的孔设置为对照组；通过分子对接中的Glide超精确模式将哌立福新与PqsE蛋白进行柔性对接，预测哌立福新与靶蛋白PqsE的结合力及结合模式；通过检测PqsE蛋白的催化底物硫醇的生成量，验证哌立福新对PqsE蛋白催化功能的抑制能力，将未加哌立福新的孔设置为对照组；最后，通过等离子表面共振试验，验证哌立福新与PqsE蛋白的结合能力。结果显示，与未加哌立福新的对照组相比较，4~8 μg/ml的哌立福新可有效抑制铜绿假单胞菌培养基底部和气-液交界面生物膜的形成；哌立福新对铜绿假单胞菌浮游菌的增殖无影响；分子对接试验提示哌立福新与PqsE蛋白具有良好的结合力，对接分数为-10.67 kcal/mol；哌立福新还能有效抑制PqsE蛋白的催化功能，与未加哌立福新的对照组相比，随着哌立福新浓度增高，PqsE蛋白酶受抑制程度越高；通过等离子表面共振试验发现PqsE蛋白与哌立福新具有良好的结合能力，且其结合常数为6.65×10 -5 mol/L。综上，哌立福新可结合PqsE蛋白，干扰PqsE蛋白的催化功能并能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。

目的:探索常春藤皂苷元（hederagenin，HE）在体外和裸鼠体内对膀胱癌细胞T24增殖能力的影响。方法:把人膀胱癌细胞T24分为对照组和实验组，实验组给予含25 μg/ml常春藤皂苷元的DMEM培养基进行培养，用CCK8检测细胞的增殖能力；将裸鼠分为对照组和实验组并注射T24细胞，实验组细胞按30 mg/kg隔天注射常春藤皂苷元。提取T24细胞和瘤块蛋白检测其p-JNK/JNK、p-p38/p38的表达量。结果:膀胱癌细胞T24经常春藤皂苷元处理后，CCK8结果显示实验组细胞增殖能力明显下降（ P<0.05）；实验组与对照组细胞p-JNK的表达量分别为（0.21±0.06）和（0.89±0.15），p-p38的表达量分别（0.38±0.09）和（1.44±0.26），p-JNK、p-p38的表达均上调（均 P<0.05）。体内实验发现，常春藤皂苷元处理后，T24细胞裸鼠皮下瘤实验组瘤块与对照组瘤块体积分别为（1192.07±250.92）μm 3和（2280.50±600.10）μm 3，质量分别为（0.65±0.29）g和（1.62±0.38）g，实验组质量和体积较对照组均下降（均 P<0.05）。提取瘤块蛋白，蛋白免疫印迹结果表明实验组与对照组细胞p-JNK的表达量分别为（0.38±0.08）和（1.03±0.19），p-p38的表达量分别（0.71±0.12）和（1.36±0.25），p-JNK、p-p38的表达均上调（均 P<0.05）。 结论:常春藤皂苷元可通过JNK/p38 MAPK信号通路抑制膀胱癌胞体外和裸鼠体内增殖能力。

目的:评价Ras同源家族成员A(RhoA)在氢减轻脂多糖(LPS)致小鼠肺微血管内皮细胞屏障功能损伤中的作用。方法:小鼠肺微血管内皮细胞培养于含10%胎牛血清和1%青链双抗的DMEM/F12培养基中，传代至第4～6代的细胞用于实验，采用随机数字表法分为6组( n＝36)：对照组(A组)、富氢液组(B组)、LPS组(C组)、LPS＋富氢液组(D组)、LPS＋RhoA抑制剂C3酶组(E组)和LPS＋富氢液＋RhoA激活剂U-46619组(F组)。A组、C组和E组采用正常培养基培养，B组、D组和F组采用含饱和氢气培养基培养，C组、D组、E组和F组加入LPS，终浓度1 μg/ml；E组于加入LPS前2 h加入C3酶，终浓度3 μg/ml；F组于加入LPS前3 h加入U-46619，终浓度10 mg/ml。分别于LPS孵育后6、12和24 h时采用Western blot法检测血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)和紧密连接蛋白(occludin)的表达；于LPS孵育后24 h时采用LDH法测定细胞LDH释放率，MTT法测定细胞活力，GST pull-down法测定RhoA活性。 结果:与A组比较，C组孵育6、12和24 h时occludin和VE-cadherin表达下调，孵育24 h时细胞活力降低，LDH释放率和RhoA活性升高( P<0.05)；与C组比较，D组孵育6、12和24 h时occludin和VE-cadherin表达上调，孵育24 h时细胞活力升高，LDH释放率和RhoA活性降低( P<0.05)；与C组比较，E组孵育6、12和24 h时occludin和VE-cadherin表达上调，孵育24 h时细胞活力升高，LDH释放率和RhoA活性降低( P<0.05)；与D组比较，F组孵育6、12和24 h时occludin和VE-cadherin表达下调，孵育24 h时细胞活力降低，LDH释放率和RhoA活性升高( P<0.05)。 结论:RhoA参与了氢减轻LPS致小鼠肺微血管内皮细胞屏障功能损伤的过程。

目的:探究体外将人诱导多能干细胞(hiPSCs)定向分化成视网膜类器官(ROs)的进程并进行小鼠在体细胞移植。方法:使用定向分化培养基使BC1-eGFP hiPSCs悬浮培养得到神经球，培养第7天时将神经球贴壁培养诱导出神经视网膜上皮结构，然后人工分离类视网膜结构悬浮培养，进一步定向诱导分化得到成熟的ROs。采用实时荧光定量PCR检测培养第0、7、15、21和30周标志基因的表达水平变化，采用免疫荧光染色法检测培养第8天、第15天、第15周、第21周和第30周标志基因的蛋白水平变化来鉴定诱导分化进程及效果。在体移植ROs实验中，首先破坏外界膜，然后将经消化的RO细胞悬液从角巩膜缘注射到 Gnat1-/-小鼠视网膜下腔，细胞移植后5个月进行视网膜切片的免疫荧光染色检测植入细胞的存活情况、与宿主视网膜的整合以及进一步的成熟分化情况。 结果:形态学和免疫荧光染色结果显示，体外诱导hiPSCs早期形成的眼区细胞高表达神经视网膜上皮特异性标志物PAX6和SOX1，随后细胞可以表达视网膜祖细胞特异性标志物LHX2，集落外圈逐渐形成圆形透明马蹄状的类视网膜结构。机械分离并悬浮培养得到的ROs直径约为1 mm，类视网膜组织逐渐增厚并出现类视网膜色素上皮细胞。实时荧光定量PCR结果显示视网膜祖细胞标志基因 VSX2表达在第7周即达峰值并持续高表达( F＝168.30， P<0.01)，视网膜前体细胞标志基因 RCVRN在第7周也开始出现并逐渐高表达( F＝271.60， P<0.01)，感光蛋白基因 RHO在第15周开始表达( F＝95.02， P<0.01)，而成熟感光细胞标志 OPN1LW/ MW的表达在第21周明显升高( F＝40.57， P<0.01)。免疫荧光染色进一步检测到感光蛋白RHO在第30周达高表达状态。RO细胞移植后3周，自身带有绿色荧光的细胞成功在宿主小鼠的视网膜外核层中长期存活，移植后5个月植入细胞表达功能性光信号转导蛋白GNAT1。 结论:体外3D培养诱导hiPSCs生成ROs可成功地模拟人体内视网膜的发育过程，移植的RO细胞能在受体小鼠眼内长期存活，进入外核层并进一步发育成熟为类感光细胞。