角膜缘微环境细胞(LNCs)是位于角膜缘、与角膜缘上皮干细胞(LESCs)紧密相连的一类间充质干细胞，能同时表达间充质标志物和多种胚胎干细胞标志物，对调节LESCs的静息、自我更新以及分化状态起着重要作用。近年研究表明，LNCs可通过胶原酶消化法、上皮块消化法、中性蛋白酶－胶原酶消化法以及组织块培养法进行体外分离培养，通过3D Matrigel共培养、Transwell共培养可研究LNCs与LESCs之间的相互作用关系。LNCs与LESCs可通过SDF-1/CXCR4、Notch、BMP、Wnt、Sonic Hedgehog、KIT/AKT等多种信号通路以及神经生长因子、角质形成细胞因子、胰岛素样生长因子等多种细胞因子相互作用。LNCs现已成为角膜上皮组织工程、眼表重建以及角膜再生等研究中的一大热点。本文就LNCs的研究背景、体外分离培养方法、与LESCs的相互作用机制及其应用前景等进行综述。

目的:探讨模拟角膜缘干细胞(LSCs)微环境诱导人多潜能干细胞(hiPSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性.方法:体外建立hiPSCs细胞系,利用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养模拟角膜缘干细胞微环境,添加小分子骨形态发生蛋白4(BMP4)和特异性转化生长因子β抑制剂(SB431542),诱导hiPSCs向角膜上皮细胞分化.采用免疫荧光染色、流式细胞方法检测角膜上皮细胞特异标志物CK3和CK12,角膜上皮细胞前体CK15,角膜缘干细胞标志物ABCG5的表达.结果:hiPSCs体外培养增殖活跃,免疫荧光染色显示干细胞特异性标志物OCT4、SOX2、TRA-1-60、NANOG呈阳性.采用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养,免疫荧光染色结果显示角膜缘干细胞标志物ABCG5及角膜上皮细胞前体标志物CK15阳性,角膜上皮细胞标志物CK3及CK12阴性;在共培养的基础上添加小分子BMP4和SB431542,免疫荧光染色及流式细胞检测结果显示角膜上皮细胞特异性标志物CK3阳性表达,且随分化时间延长表达比例增高.结论:模拟角膜缘干细胞微环境同时添加小分子SB431542及BMP4,可成功诱导体外培养的hiPSCs向角膜上皮细胞分化.

角膜缘干细胞(LSCs)移植是治疗化学眼烧伤、Stevens-Johnson综合征等导致的角膜缘干细胞缺乏的主要方法,也是全身干细胞移植领域临床转化最为成功的移植方法.近年来,LSCs移植取得了一系列重要的进展,但仍然存在许多问题,面临多种挑战.将来应在获取稳定种子细胞来源、寻找新的载体材料、提高干细胞扩增效率、改善基质微环境、抑制免疫排斥等方向继续努力,进一步提高LSCs的临床疗效,开创LSCs移植的新局面.

背景:Wnt信号通路在干细胞的调控中发挥重要作用,但是其对于角膜缘干细胞的调控作用尚不十分明确.目的:探讨Wnt信号通路对角膜缘干细胞的调控作用及其在角膜缘干细胞缺乏症治疗中的疗效.方法:大鼠角膜缘组织中依次加入Dispase和Trypsin/EDTA进行消化,将消化后的角膜缘干细胞悬液接种于3D-Matrigel微环境中培养,实验组培养体系中加入Wnt信号通路激活剂氯化锂(500μmol/L),对照组不加氯化锂,培养第7天qRT-PCR检测角膜缘干细胞中p63α、CK12、CEBPδ和Ki67的表达,免疫荧光染色检测角膜缘干细胞中β-catenin的表达.采用碱烧伤法建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型,治疗组大鼠结膜下注射激活了Wnt信号通路的角膜缘干细胞,对照组大鼠结膜下注射等量PBS,随后每天使用裂隙灯观察,治疗后第4天取角膜缘组织进行免疫荧光染色、苏木精-伊红染色.结果与结论:①角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养微环境中呈球形聚集生长,对照组角膜缘干细胞中β-catenin呈阴性,实验组角膜缘干细胞中β-catenin在细胞浆和细胞核内聚集;②qRT-PCR结果显示:对照组与实验组之间干性指标p63α、CK12和功能指标CEBPδ差异均无显著性意义(P>0.05);实验组增殖指标Ki-67较对照组水平明显升高,差异有显著性意义(P<0.05);③建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型,治疗组大鼠角膜组织混浊评分较对照组明显减低,差异有显著性意义(P<0.05),角膜组织苏木精-伊红染色可见治疗组大鼠角膜上皮细胞排列整齐,细胞大小较均一,修复情况较良好,免疫荧光结果显示治疗组大部分角膜上皮细胞中β-catenin在细胞浆以及细胞核内聚集,而对照组角膜上皮细胞中β-catenin仅是弱阳性,未见在胞浆聚集或者进核;④结果表明,Wnt信号通路的激活增强了角膜缘干细胞的增殖能力,同时能够维持细胞干性,角膜缘干细胞进入干细胞自我更新状态;激活Wnt信号通路后的角膜缘干细胞可促进角膜缘干细胞缺乏模型大鼠角膜上皮的修复,减轻角膜混浊程度;通过调控Wnt信号通路改变角膜缘干细胞的功能特性可能成为治疗角膜缘干细胞缺乏症的新途径.

目的:探讨内毒素全身注射所致的角膜改变.方法:使用抗单核细胞、巨噬细胞和MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞的单克隆抗体,用标准的ABC方法于内毒素注射前、后制备的角膜平片上进行免疫组织化学染色.结果:发现在正常角膜中央区实质内有散在分布的巨噬细胞,越近角膜缘分布越密集,MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞则仅存在于角膜缘;内毒素注射后,中央区角膜单核巨噬细胞增多,这些细胞于角膜实质内发生了一系列形态学改变,MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞仅见于注射后早期的中央区角膜内皮面.结论:内毒素诱导的角膜中巨噬细胞的增多可能是机体应激状态下的重要防御机制,角膜实质中MHC-Ⅱ类抗原的缺如则对维持角膜局部免疫微环境的稳定性有重要意义.