目的:探讨艾司氯胺酮对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及可能的作用机制.方法:收集26例肝癌患者的癌组织和癌旁组织.实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肝癌组织和细胞微小RNA(miR)-449b-5p和转化生长因子-β诱导因子同源盒2(TGIF2)mRNA表达.选取上述基因变化最显著的细胞进行后续实验.将肝癌SK-Hep-1细胞分为对照组(正常培养)、艾司氯胺酮-L组(1 mmol/L艾司氯胺酮处理)、艾司氯胺酮-H组(2 mmol/L艾司氯胺酮处理)、艾司氯胺酮-H+inhibitor NC组(转染inhibitor NC+2 mmol/L艾司氯胺酮处理)、艾司氯胺酮-H+miR-449b-5p inhibitor组(转染miR-449b-5p inhibitor+2 mmol/L艾司氯胺酮处理).细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖.划痕实验检测细胞迁移能力.Transwell实验检测细胞侵袭能力.流式细胞术检测细胞凋亡情况.Western blot检测细胞中肿瘤增殖细胞核抗原(Ki-67)、半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、TGIF2蛋白表达量.双荧光素酶报告基因实验验证miR-449b-5p和TGIF2的靶向关系.结果:肝癌组织和细胞TGIF2 mRNA表达水平升高,miR-449b-5p表达水平降低(均P＜0.05).与对照组比较,艾司氯胺酮-L组、艾司氯胺酮-H组以及艾司氯胺酮-H+inhibitor NC组SK-Hep-1细胞中miR-449b-5p表达水平、细胞凋亡率及Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,TGIF2 mRNA表达水平、OD450值(24、48 h)、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数及Ki-67、MMP-9、VEGF-A、TGIF2蛋白表达水平降低(均P＜0.05).与艾司氯胺酮-H+inhibitor NC 组比较,艾司氯胺酮-H+miR-449b-5p inhibitor 组 SK-Hep-1 细胞miR-449b-5p表达水平、细胞凋亡率及Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,TGIF2 mRNA表达水平、OD450值(24、48 h)、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数及Ki-67、MMP-9、VEGF-A、TGIF2蛋白表达水平升高(均P＜0.05).miR-449b-5p mimic+TGIF2-WT组荧光素酶活性低于miR-NC+TGIF2-WT组(P＜0.05).结论:艾司氯胺酮通过上调miR-449b-5p/TGIF2轴抑制肝癌细胞的恶性生物学行为.

目的 研究miR-138-5p对高糖诱导的人肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)的影响.方法 将HK-2细胞分为正常组(NG,5 mmol/L D葡萄糖)、高糖组(HG,30 mmol/L D葡萄糖)、HG+miR-138-5p抑制剂转染组及HG+抑制剂对照转染组.RT-PCR检测高糖处理对miR-138-5p表达的影响;Westernblot检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、同源盒蛋白A13(HOXA13)、骨形成蛋白7(BMP-7)、转化生长因子β1(TGF-β1)和Smad7等的表达;荧光素酶活性实验检测miR-138-5p与HOXA13的靶向关系.结果 高糖刺激后,miR-138-5p表达升高约1.5倍(P＜0.05),α--SMA表达升高1.8倍,而E-cadherin表达下降;高糖促进TGF-β1的表达,抑制HOXA13、BMP-7和Smad7的表达(P＜0.05).miR-138-5p抑制剂转染组α-SMA和E-cadherin的表达均接近NG组,且miR-138-5p抑制剂转染组T GF-β1表达下降约1.1倍,同时HOXA13、BMP-7和Smad7表达升高(P＜0.05).结论 抑制MiR-138-5p表达可通过靶向调节HOXA13的表达,提高BMP-7和Smad7水平,抑制TGF-β1信号通路,进而抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT的发生.

目的:探讨沉默锌指E盒结合同源框1(ZEB1)基因对胶质瘤U87细胞间质标志物表达和细胞迁移的作用,阐明ZEB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化(EM T)的影响.方法:将构建的ZEB1短发夹RNA(shRNA)干扰质粒(shZEB1#1和shZEB1#2)和对照质粒(shCtrl)转染至胶质瘤U87细胞,Western blotting法检测干扰效果.将胶质瘤U87细胞分为对照组(转染shCtrl的胶质瘤U87细胞)、EM T组[转染shCtrl的胶质瘤U87细胞用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导EM T]和ZEB1基因沉默组(转染shZEB1的胶质瘤U87细胞用TGF-β1诱导EMT).Western blotting法检测各组细胞中间质标志物(N-钙黏蛋白和波形蛋白)及基质金属蛋白酶9(M M P-9)的蛋白表达水平,划痕愈合实验检测各组细胞的迁移率.结果:Western blotting法检测,转染shZEB1#1和shZEB1#2的胶质瘤U87细胞中ZEB1蛋白表达水平较转染shCtrl的细胞明显降低(P<0.05或P<0.01),shZEB1#2对ZEB1表达的抑制效果更明显,表明ZEB1已稳定转染到U87细胞.与对照组比较,EM T组胶质瘤U87细胞中N-钙黏蛋白、波形蛋白和M M P-9蛋白表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01);与EMT组比较,ZEB1基因沉默组N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01).EMT组细胞迁移率明显高于对照组(P<0.01),而ZEB1基因沉默组细胞迁移率明显低于EMT组(P<0.01).结论:沉默ZEB1基因表达可抑制胶质瘤U87细胞EMT,并降低细胞迁移能力,提示ZEB1可作为侵袭性胶质瘤治疗的重要靶标.

目的 探讨miR-328在小鼠胚胎干细胞体外分化胰岛素分泌细胞过程中的调控作用及分子机制.方法 小鼠胚胎干细胞系mESCs-Nanog-GFP经条件培养基诱导后,分为阴性对照组、转染miR-328激动剂组、转染miR-328拮抗剂组和转染转化生长因子β2(TGF-β2)小干扰RNA组.通过实时荧光定量PCR (qPCR)、免疫荧光鉴定胰岛素分泌细胞功能;qPCR、免疫荧光及酶联免疫吸附(ELISA)检测多系前体细胞过表达及抑制miR-328对胰岛素分泌细胞分化的影响;生信分析预测miR-328与TGF-β2结合位点,双荧光素酶报告基因及Western印迹法验证两者调控关系.结果 miR-328激动剂可成功转染小鼠胚胎干细胞,转染效率为70％～80％,使胰岛功能相关基因表达均有不同程度下降,且葡萄糖刺激胰岛素释放量减少,胰岛素、NK6同源盒1蛋白表达下降(均P＜0.05);转染miR-328拮抗剂上调胰岛功能相关基因及转录因子表达(均P＜0.05).双荧光素酶报告基因实验发现miR-328可结合至TGF-β2的3'端非编码区(3'-UTR),Western印迹检测显示转染miR-328拮抗剂组TGF-β2蛋白相对表达量1.00±0.01,共转染miR-328拮抗剂组和TGF-β2小干扰RNA组蛋白相对表达量0.80±0.03,转染TGF-β2小干扰RNA组蛋白相对表达量0.20±0.01.敲降TGF-β2下调胰腺早期转录因子表达(P＜0.05),抑制Pdx1+细胞分化.结论 miR-328能够靶向TGF-β2抑制小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞的分化,为糖尿病干细胞治疗提供了新的调控途径.

目的 探讨白花蛇舌草提取物熊果酸、齐墩果酸对结肠癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制.方法 不同浓度的熊果酸、齐墩果酸作用结肠癌(HCT-8)细胞24、48、72 h后,CCK-8法、平板克隆形成实验检测HCT-8细胞的存活情况.筛选最佳实验条件,将细胞分为对照组和实验组,各组细胞做成细胞爬片,细胞免疫荧光检测YAP1蛋白水平.各组细胞消化离心做成细胞蜡块,免疫组织化学方法检测YES相关蛋白(YAP1)、p53基因(p53)、尾型同源盒转录因子2(CDX-2)、白介素6(IL-6)、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源等位基因(PTEN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的蛋白水平.结果 白花蛇舌草提取物可不同程度抑制结肠癌HCT-8细胞的增殖.细胞免疫荧光结果显示,对照组YAP1蛋白表达较实验组强.免疫组化结果显示YAP1的表达与TNF-α的表达有一定相关性.结论 白花蛇舌草提取物通过抑制Hippo-YAP信号通路的活性,抑制结肠癌HCT-8细胞的增殖,诱导其凋亡.白花蛇舌草提取物可能是一种潜在的肠癌治疗药物.

目的:探讨食源性栀子方(ZZP)对四氯化碳(CC14)所致急性和亚急性肝损伤的保护作用及机制.方法:建立急性和亚急性肝损伤动物模型.C57小鼠随机分为正常组、模型组、奥贝胆酸组、食源性栀子方(简称复方)高、低剂量组(0.5、0.25 g·kg-1),根据急性、亚急性实验设计,末次给药后,分别收集各组小鼠的血清和肝脏组织.苏木素-伊红(HE)和天狼猩红染色观察肝脏病理变化;试剂盒测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL),肝匀浆羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肝脏组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肝组织胶原1a1(Col1a1)、胶原3a1(Co13a1)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子β受体Ⅱ(Tgfbr2)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达.结果:急性肝损伤:与正常组比较,模型组小鼠的ALT、AST、TBIL、MDA、水平均显著升高(P＜0.01),肝SOD酶活性显著性降低(P＜0.01).与模型组比较,复方高、低剂量组复方可明显降低肝细胞损伤程度,均能保护CC14所诱导的急性肝损伤,复方高剂量组效果优于低剂量组.亚急性肝损伤:模型组小鼠的ALT、AST、MDA、TNF-α和IL-6水平均显著升高(P＜0.01),肝SOD酶活性显著降低(P＜0.01).与模型组小鼠比较,复方高、低剂量组肝脏Hyp含量显著降低(P＜0.01),两组肝组织胶原沉积程度明显减轻,复方 高剂量组亦可明显下调小鼠肝脏α-SMA、Col1a1、C013a1、FN和Tgfbr2mRNA表达(P＜0.05,P＜0.01).结论:复方可有效保护CC14诱导的急性和亚急性肝损伤,保护效应与浓度成正比,其机制可能与增加肝组织抗氧化酶的活性,降低脂质过氧化水平,抑制炎性反应有关,从而减少胶原沉积,改善早期肝纤维化.

目的:研究慢病毒转染沉默乙酰肝素酶(HPA)联合那屈肝素(nadroparin)的协同抗肿瘤作用,并探讨其潜在的分子机制.方法:以肺癌A549细胞系为研究对象,探讨利用慢病毒介导沉默HPA和/或联合那屈肝素处理后对A549细胞的影响.抑制试验共设6组,分别为空白对照组(A549细胞)、阴性对照组(转染阴性对照shRNA序列)、沉默HPA组(转染HPA shRNA)、空白对照+那屈肝素组、阴性对照+那屈肝素组和shRNA+那屈肝素联合组.分别采用CCK-8检测各组细胞活力,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养液中转化生长因子(TGF-β1)含量,体外侵袭实验(transwell)检测各组细胞迁移和侵袭能力的差异,Western blot检测各组细胞TGF-β信号通路中主要蛋白TGF-β1、磷酸化Smad2/3、锌指E盒结合同源框1(ZEB-1)、锌指转录因子SNAIL、TWIST相关蛋白、E钙黏蛋白(E-cadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达情况.结果:通过慢病毒转染shRNA,成功建立了HPA沉默的A549细胞株.与2个对照组相比,各组细胞经沉默HPA和/或联合那屈肝素处理后,CCK-8检测结果显示,单独抑制HPA或那屈肝素处理可轻微抑制细胞活力,而联合处理会显著抑制细胞活力(P<0.05);单独处理后TGF-β1的表达减少(P均<0.05),联合组TGF-β1表达减少更显著(P<0.05);单独HPA沉默或那屈肝素均能抑制细胞迁移和侵袭能力,两者联合时效果更显著(P<0.05).Western blot同样证实了HPA沉默或那屈肝素均可不同程度诱导TGF-β1、p-Smad2/3、ZEB-1、TWIST、SNAIL、N-cadherin和MMP-2表达下调(P均<0.05),E-cadherin表达上调(P<0.05),且联合处理组效果更显著(P<0.05).结论:沉默HPA联合那屈肝素可显著抑制肺癌细胞侵袭和迁移,并上调E-cadherin表达.此过程可能与TGF-β1介导上皮细胞转化过程中关键转录因子ZEB-1、TWIST和SNAIL的抑制有关.

目的:利用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激人胚肺成纤维细胞(HFL1)模拟特发性肺纤维化(IPF)的病理过程,探讨柴胡含药血清对IPF的作用和机制.方法:采用10μg·L-1TGF-β1刺激HFL1细胞,给予不同体积分数柴胡含药血清(5％、10％、15％、20％)干预24h后,利用细胞增殖与活性检测试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖率.随后细胞分为空白血清组(20％空白血清)、TGF-β1组(20％空白血清和10 μg·L-1 TGF-β1)、TGF-β1+柴胡含药血清组(5％空白血清、15％含药血清和10 μg·L-1 TGF-β1)、TGF-β1+SIS3组(3 μmol·L-1 SIS3、20％空白血清和10 μg·L-1 TGF-β1).采用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡率;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达情况;通过免疫荧光法检测α-SMA、脑Ras同源蛋白(Rheb)、磷酸化(p)-Smad3蛋白表达;蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测Rheb、p-Smad3、Smad3蛋白表达.结果:与空白血清组比较,TGF-β1组细胞增殖率明显上升(P＜0.05).与TGF-β1组比较,TGF-β1+15％柴胡含药血清组和TGF-β1+20％柴胡含药血清组细胞增殖率显著降低(P＜0.01).与空白血清组比较,TGF-β1组细胞凋亡率显著下降,Bcl-2、α-SMAmRNA表达增加,BaxmRNA表达减少,α-SMA、Rheb蛋白表达增加,Smad3磷酸化水平明显上升(P＜0.05);与TGF-β1组比较,TGF-β1+柴胡含药血清组和TGF-β1+SIS3组细胞凋亡率显著上升,Bcl-2、α-SMA mRNA表达减少,Bax mRNA表达增加,α-SMA、Rheb蛋白表达减少,Smad3磷酸化水平下降(P＜0.05).结论:柴胡能够抑制TGF-β1诱导的HFL1细胞增殖和肌成纤维细胞转化,促进成纤维细胞凋亡,该作用可能与Smad3/Rheb轴有关.

胃黏膜肠上皮化生(GIM)是一种癌前病变,增加了后续胃癌(GC)发展的风险.因此,GIM一直是基础和临床研究的重点.尾型同源盒转录因子2(CDX2)是调节肠上皮细胞表型的肠特异性转录因子,主要存在于小肠和结肠,在正常胃黏膜中很少表达.幽门螺杆菌感染已被公认为GIM的主要致病因素,其通过核因子-kappaB信号通路及其下游的促炎因子、转化生长因子-β信号通路以及Sonic Hedgehog基因(Shh)来增加CDX2的表达,从而引起GIM.然而,越来越多的研究表明,胆汁反流引起的胃黏膜慢性炎症同样也是GIM的关键致病因素.胆汁反流通过其微小RNA、外泌体、表观遗传学及胆汁酸受体激活GIM生物标志物的表达导致GIM的发生和发展.目前,两大因素之外诱导CDX2的相关研究仍然很少.现对目前该领域的相关进展进行综述,为进一步研究提供参考.