目的 考察透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠埃希菌(E.coli)和龟裂链霉菌(S.rimosus)中的表达,研究在不同溶氧条件下表达的透明颤菌血红蛋白(VHb)对龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响.方法 将vgb插入表达型质粒pET-28a中,导入E.coli BL21 (DE3)用以表达VHb并测定其活性.以整合型质粒pSET152为载体,利用ermE*启动子组成型表达vgb基因,将构建的质粒通过接合转移整合到S.rimosusM4018基因组上,利用CO差示光谱法和SDS-PAGE鉴定两个重组菌中的血红蛋白.在5L罐上考察不同溶氧条件下VHb的表达对重组龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响.结果 重组大肠埃希菌和重组龟裂链霉菌都能够表达具有生物活性的VHb,发酵结果表明,在117h时与对照菌相比,重组龟裂链霉菌在高氧和低氧条件下的干重分别提高了6％和32％,同时单位干重土霉素的产量分别提高了41％和93％.结论 VHb在重组龟裂链霉菌中成功表达,改善了菌体的生长和土霉素的合成,为解决工业发酵过程中氧限制问题提供了策略.

在以阿魏酸为底物生物法转化香兰素过程中,通过Red重组技术用外源的透明颤菌血红蛋白基因(vgb)取代大肠杆菌基因组icdA基因,使菌株可以适应高密度、低溶氧发酵,为香兰素的发酵生产提供新的尝试.CO差光谱分析显示整合的vgb基因表达产生了VHb,且该蛋白具有活性.发酵结果显示表达了vgb基因的新菌株与原重组菌株相比在低氧环境下仍能维持较高的生物量,且香兰素产量由原来的1 668 mg/l上升到2 240 mg/l,提高了约34.2％.

地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限,为了拓展和丰富其基因编辑手段,在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证.首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF,两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点;将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除;最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收.为进一步验证本系统的实用性及编辑效率,构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb,并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入.结果显示,成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因,敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3％和80.4％;vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因,并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达.文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并进行了基因敲除及基因敲入验证,为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考.

透明颤菌血红蛋白基因vgb在多种研究和工业发酵菌中异源表达很好的解决了高密度发酵中的溶氧率问题.酿酒酵母是经典的真核模型,且在发酵工业中具有重要的应用价值,但vgb在酿酒酵母中异源表达对细胞生长的影响并不清楚.以ADH1为启动子构建了含透明颤菌(Vistreoscilla)血红蛋白基因vgb的异源表达质粒YEplac195-ADH1pr-vgb,并转化至酿酒酵母BY4741.通过生长敏感性实验,发现在发酵碳源和非发酵碳源中,vgb的异源表达均抑制了菌株生长.接着,通过2 ',7'-二氯荧光黄双乙酸盐和PI染色和脂质过氧化产物检测分析,发现过表达vgb的酿酒酵母细胞中活性氧(ROS)的积累、细胞膜通透性改变以及脂质过氧化.结果 表明,酿酒酵母中过表达vgb改变细胞的氧化状态促进活性氧的累积,氧化应激导致菌株的生长抑制.