通过代谢工程策略改造酿酒酵母胞内辅因子的形式和浓度,分析辅因子NADPH对于产物S-腺苷蛋氨酸(SAM)合成的作用并总结能量代谢和其他物质代谢的规律,为高产SAM菌株的代谢工程改造提供理论基础.由于酿酒酵母中的NADPH在线粒体和细胞质中的代谢相对独立,因此以酿酒酵母BY4741单倍体模式菌株为研究对象,研究了不同亚细胞结构内NADPH对于产物合成的影响.通过激光共聚焦显微镜证实了NADH激酶在酿酒酵母线粒体和细胞质中的表达.实验结果表明NADPH的提高有利于酿酒酵母胞内SAM的合成.发酵24 h,菌株NBYSM-1胞内SAM浓度较对照菌提高3.28倍,菌株NBYSM-2胞内SAM浓度提高1.79倍.其中重组菌株NBYSM-1合成SAM的能力和胞内NADPH/NADP+比率均明显高于重组菌株NBYSM-2.因此,NADPH调控策略有望成为提高SAM产量的有力工具并应用于其他辅因子依赖化合物的合成.

目的 原核表达、纯化梅毒螺旋体(Treponema pallidum)蛋氨酸亚砜还原酶(Methionine sulfoxide reductase,Msr)并测定其抗氧化功能. 方法 将TpMsr基因连接到表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-TpMsr,热激法将其转化大肠埃希菌BL21 (DE3)得到重组菌BL/pET28a-TpMsr,IPTG诱导重组TpMsr蛋白表达.利用镍柱亲和层析纯化目的蛋白,采用比色法测定Tp Msr蛋白的酶活性.采用菌落计数法测定重组大肠埃希菌在H2O2胁迫下的存活率. 结果 成功构建重组质粒pET28a-TpMsr,转化大肠埃希菌BL21 (DE3)后高效表达分子质量单位(Mr)约34.8×103的TpMsr,经Ni2+柱亲和层析纯化得到高纯度的重组TpMsr蛋白.该蛋白能将蛋氨酸亚枫还原为蛋氨酸,且能赋予大肠埃希菌抵抗氧化应激的能力. 结论 构建的重组质粒pET28a-TpMsr能表达TpMsr蛋白.该蛋白具有抗氧化功能,为研究梅毒螺旋体的抗氧化机制提供了实验依据.

目的:优化两种重组蛋氨酸酶表达的诱导条件,并探讨其对宣威人肺腺癌细胞GLC的抑制作用.方法:将重组蛋氨酸酶表达质粒PGEX-4T1-4A1-MGL和PGEX-4T1-3B8-MGL转染至感受态大肠杆菌DH5α中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达.以目标蛋白表达量为指标,采用单因素试验对诱导前菌液起始光密度(OD600 nm)值、培养温度、诱导时间等诱导条件进行优化.采用亲和层析法对所得重组蛋氨酸酶4A1-MGL、3B8-MGL进行纯化;采用考马斯蓝法检测其质量浓度,十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其纯度,分光光度法检测其活性.采用MTT法检测经低、中、高剂量重组蛋氨酸酶(4A1-MGL和3B8-MGL分别均为0.1、0.2、0.4 U/mL)作用24、48、72 h后的细胞增殖情况,并计算细胞抑制率.结果:两种重组蛋氨酸酶表达的最优诱导条件为菌液起始OD600 nm值0.9、培养温度37℃、诱导时间5 h.验证试验结果显示,4A1-MGL、3B8-MGL的蛋白表达量分别为1.52±0.04、1.28±0.03(RSD<3％,n=3).经纯化后,4A1-MGL的质量浓度为(0.70±0.02)mg/mL,纯度为(96.42±3.15)％,活性为(0.45±0.02)U/mg;3B8-MGL的质量浓度为(0.56±0.02)mg/mL,纯度为(97.43±2.96)％,活性为(0.91±0.03)U/mg.经低、中剂量4A1-MGL和3B8-MGL作用48、72 h,高剂量4A1-MGL和3B8-MGL作用24、48、72 h后,GLC细胞的抑制率均显著升高,且高剂量组作用72 h时显著高于同时间点低、中剂量组(P<0.05).结论:本研究成功优化了重组蛋氨酸酶表达的诱导条件,所得4A1-MGL和3B8-MGL可剂量依赖性地抑制GLC细胞增殖.

目的 分析血清蛋氨酸水平在预测药物性肝损伤严重程度中的临床价值.方法 选取211例实验对象,其中选取我院124例药物性肝损伤患者作为实验组,根据其肝损伤的严重程度分为轻、中、重度3组,其中轻组43人,中组46人,重组35人;另外选择87例健康体检者作为正常对照组;对比上述4组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)及蛋氨酸(MET)水平,以此进行分析.结果 治疗前轻、中、重度3组药物性肝损伤患者的ALT、AST、ALP、TBIL及MET均高于正常对照组;随着肝损伤程度加重,血清MET水平逐渐升高,各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);MET诊断药物性肝损伤的AUC、敏感度、特异度为0.911,86％,98％;经Pearson相关性分析发现,治疗前药物性肝损伤患者的MET与ALT、AST、ALP、TBIL均呈正相关(P<0.05).治疗3 d后,轻、中、重度肝损伤组的MET水平低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05).经治疗2 w后,治疗有效者的MET指标低于治疗无效者,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 血清蛋氨酸水平可作为药物性肝损伤的辅助诊断指标,且可作为预测药物性肝损伤严重程度及预后的指标.