目的:探讨stomatin蛋白表达对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用实时定量PCR检测人支气管肺上皮细胞（HBE）和人肺癌细胞（H520、A549、95D、H460、Glc-82、973和H1299）stomatin mRNA表达水平。采用免疫组织化学染色检测4张肺癌组织芯片（含259份人肺癌及其癌旁组织）stomatin蛋白表达情况。敲降A549细胞stomatin基因表达后，噻唑蓝比色法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western印迹法检测细胞中总蛋白激酶B（AKT）和丝氨酸473位点磷酸化AKT的表达水平。采用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验检测敲降stomatin蛋白表达对A549细胞成瘤能力的影响，采用组织芯片染色检测肿瘤组织中stomatin蛋白、核增殖抗原（Ki67）及血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）表达情况。结果:H520、A549、95D、H460、Glc-82、973、H1299和HBE细胞stomatin mRNA表达水平 M（极差）分别为2.71（2.66）、3.55（3.16）、0.26（0.22）、2.08（1.98）、0.87（0.35）、1.72（2.53）、1.10（1.82）和0.01（0.02），H520、A549和H460细胞高于HBE细胞（ P值均<0.05），95D、Glc-82、973、H1299与HBE细胞差异无统计学意义（ P值均>0.05）。stomatin蛋白在人肺癌组织的表达阳性率为34.7%（90/259），高于正常组织[1.9%（5/259）]（ P<0.05）。stomatin表达阳性肺癌组织中，低表达组（67例）肿瘤大小 M（ IQR）为[41.22（2 761.50）]cm，小于高表达组[23例，57.98（1 333.50）cm]（ P<0.05）。敲降stomatin基因表达的A549细胞第4天的吸光度值为0.55±0.07，低于对照细胞（0.79±0.16）（ P=0.012）；早期凋亡细胞占比[ M（ IQR）]为8.83（53.00），高于对照细胞[4.17（25.00）]（ P=0.026）；丝氨酸473位点磷酸化AKT蛋白表达水平为0.68±0.16，低于对照细胞（1.16±0.39）（ P<0.05），AKT总蛋白表达水平 M（ IQR）为4.25（17.00），与对照细胞[4.75（19.00）]差异无统计学意义（ P>0.05）；将敲降stomatin基因表达的A549细胞接种裸鼠腋下43 d后，肿瘤体积为（37.93±3.12）mm 3，小于对照组[（454.04±32.39）mm 3]（ P<0.001），肿瘤组织stomatin、Ki67和CD31表达水平分别为1.78±0.69、5.19±3.84和10.77±1.67，均低于对照组（分别为17.52±8.76、54.14±41.02和19.72±6.97）（ P值均<0.05）。 结论:stomatin可通过调控AKT信号通路促进肺癌细胞增殖并抑制细胞早期凋亡。

目的 研究白及多糖对高脂高糖环境下人脐静脉内皮细胞的影响,揭示白及多糖促进糖尿病足溃疡早期愈合的分子机制.方法 用葡萄糖、棕榈酸干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模拟糖尿病体内高糖、高脂环境的血管内皮损伤模型,CCK-8法检测棕榈酸、白及多糖、通路抑制剂ICG-001最佳作用浓度及白及多糖细胞毒性,镜下观察最佳浓度葡萄糖、棕榈酸、白及多糖、ICG-001干预后的细胞生长状态,跨内皮细胞电阻实验检测细胞生长情况,免疫荧光法检测β-连环蛋白(β-catenin)在细胞中的核易位情况,Western blot法检测细胞中β-catenin、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、c-Myc蛋白表达情况,RT-PCR法检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA表达情况.结果 确定葡萄糖最佳浓度为25 mmol/L、棕榈酸为300 μmol/L、白及多糖为300 μg/mL、ICG-001为10 μmol/L,使用最佳浓度葡萄糖和棕榈酸诱导建立血管内皮损伤模型.葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L组、葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L+ICG-001组细胞处于生长抑制状态,黏附性下降,细胞活力明显降低;葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L+白及多糖组、葡萄糖+棕榈酸300μmol/L+ICG-001+白及多糖300 μg/mL组细胞碎片及形态异常的细胞数量明显减少,黏附性较前加强,细胞活力明显增高.葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L组电阻TEER值、胞浆胞核中β-catenin蛋白相对表达量、细胞核中c-Myc蛋白相对表达量及细胞中VEGF、bFGF mRNA相对表达量均明显低于正常对照组(P均＜0.05),细胞质中GSK-3β蛋白相对表达量明显高于正常对照组(P＜0.05),β-catenin在胞浆胞核表达的荧光强度较弱,葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L+白及多糖组上述指标均逆转.葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L+ICG-001组电阻TEER值、胞浆胞核中β-catenin蛋白相对表达量、细胞核中c-Myc蛋白相对表达量及细胞中bFGF mRNA相对表达量均明显低于葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L组(P＜0.05),β-catenin在胞浆胞核表达的荧光强度均较弱,葡萄糖+棕榈酸300 μmol/L+ICG-001+白及多糖组上述指标均逆转.结论 白及多糖可通过激活Wnt/β-catenin通路,促血管生成,从而达到修复糖尿病足溃疡创面的作用.

目的:利用血清药理学,探究用于肝细胞脂肪变性药效观察的肝龙胶囊(GLC)含药血清的最佳取血时间和含药血清体积分数.方法:C57BL/6J小鼠60只,灌胃GLC(90 mg/kg),每日两次,连续7 d,分别在末次给药0.5、1、2和4 h心脏采血,收集血清.对照组小鼠灌胃同体积的生理盐水.LC-MS/MS技术检测空白血清及不同采血时间含药血清肌苷含量,确定最佳采血时间.应用0%、1%、3%和10%GLC血清处理棕榈酸(PA)刺激的小鼠肝细胞NCTC1469,尼罗红染色检测细胞脂滴生成,RT-qPCR检测细胞内脂肪酸生成基因Fabp1和Scd1,及脂肪酸β-氧化基因Pparα的表达.结果:(1)LC-MS/MS检测发现在末次给药2 h后血清中肌苷浓度最高.(2)尼罗红染色显示GLC血清对PA诱导的肝细胞脂质积累具有剂量依赖性的减少趋势.(3)1%和3%和10%GLC血清处理均能显著下调PA刺激的肝细胞内Fabp1和Scd1的表达,且具有剂量依赖性的减少趋势;1%、3%和10%GLC血清处理均能显著上调PA刺激的肝细胞内Pparα的表达,且具有剂量依赖性的增加趋势.结论:小鼠给药后2 h的10%GLC血清是用于肝细胞脂肪变性药效观察的最佳血清干预浓度.

冬虫夏草(cordyceps sinensis,CS)是东方社会历史悠久的强壮滋补类草药,可以增强生殖活动并恢复受损的生殖功能.CS成分复杂,其主要提取成分包括虫草素、异黄酮(isoflavones obtained from Cordyceps sinensis,CSIF),以及CS水提取成分F1(水溶性多糖)、F2(水溶性蛋白质)和F3(水溶性较差的多糖和蛋白质).截至目前,关于CS及其成分在生殖功能中的作用、具体机制及临床应用尚无系统阐述.首次综述CS及其成分对雌性及雄性生殖类固醇激素生成的体内外作用及机制.在雌性生殖系统中,CS通过上调类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenesis acute regulator protein,St AR)和芳香化酶(aromatase,AROM)的表达促进人颗粒黄体细胞(granulosa luteal cell,GLC)中雌二醇(estradiol,E2)的生成,此外,口服从CS中提取的CSIF对去卵巢(ovariectomized,OVX)大鼠具有显著的雌激素作用;在雄性生殖系统中,CS及其不同成分不仅对原代小鼠睾丸间质细胞中睾酮及小鼠睾丸间质肿瘤细胞(MA-10细胞)中孕酮生成有积极作用,还可显著提高小鼠血浆睾酮水平.不仅为研究CS调节生殖功能及在辅助生殖技术中的应用提供新的研究方向,同时提供新的临床治疗策略.

目的 探讨糖萼组分在不同类型抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)中的变化及其与疾病活动度的关系.方法 纳入49例AAV患者(AAV组)和53例健康者(对照组).采用PCR仪辅助酸降解法和高效液相色谱检测两组受试者6种血清降解单糖水平.比较AAV组和对照组受试者、肉芽肿性多血管炎(GPA)和显微镜下多血管炎(MPA)患者、髓过氧化物酶(MPO)-ANCA和蛋白酶3(PR3)-ANCA阳性AAV患者、非活动、活动和高度活动AAV患者血清降解单糖水平.采用Spearman相关分析评估AAV患者血清降解单糖水平与各临床指标的相关性.采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清降解半乳糖胺(GalN_de)水平对MPO-ANCA阳性AAV疾病高度活动的预测价值.结果AAV组受试者血清降解岩藻糖(Fuc_de)、GalN_de、降解葡萄糖(Glc_de)、降解甘露糖(Man_de)、总血清降解单糖水平均高于对照组(P＜0.05).MPA患者总血清降解单糖水平高于GPA患者(P＜0.05).MPO-ANCA阳性AAV患者总血清降解单糖水平高于PR3-ANCA阳性AAV患者(P＜0.05).非活动、活动及高度活动AAV患者血清GalN_de水平比较差异有统计学意义,其中高度活动患者高于非活动患者(P＜0.05).Spearman相关分析结果显示,AAV患者血清Fuc_de与血中性粒细胞计数及红细胞沉降率(ESR)均呈负相关,Glc_de、Man_de及总血清降解单糖水平与ESR及C反应蛋白(CRP)均呈正相关(P＜0.05).ROC曲线分析结果显示,血清GalN_de水平预测MPO-ANCA阳性AAV疾病高度活动的ROC曲线下面积(AUC)为 0.838(95％CI 0.695～0.982,P=0.009),最佳截断值为 0.204 mmol/L,敏感度为 83.3％,特异度为79.4％.结论 AAV患者血清糖萼降解后的单糖水平与疾病类型及疾病活动度相关.

目的 建立H2O2诱导视网膜色素上皮细胞ARPE-19(acute retinal pigment epithelial-19)细胞损伤模型,研究蓝莓花青素对细胞的保护作用.方法 采用MTT法测定细胞存活率,免疫荧光法测定细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平.以浓度0～3 200 μmol·L-1的H2O2为诱导剂,刺激细胞2、6、24 h,用1、5、10 mg·L-1花青素提取物(blueberry anthocyanin extract,BAE)预处理细胞6、24 h,比较对细胞的保护作用,确定H2O2的浓度及诱导时间.通过ARPE-19细胞损伤模型的建立,研究蓝莓花青素对细胞的保护作用.结果 以800 μmol·L-1 H2O2刺激2h为条件,建立ARPE-19细胞损伤模型,细胞存活率为63.69％.5 mg·L-1蓝莓花青素提取物、锦葵色素(malvidin,My)及其葡萄糖苷(malvidin-3-glucoside,Mv-3-glc)和半乳糖苷(malvidin-3-galactoside,Mv-3-gal)预处理6h后,细胞存活率明显提高(P＜0.01),分别达到86.57％、115.72％、98.15％、127.97％;细胞中ROS水平明显下降(P＜0.05),依次减少52.38％、95.38％、77.55％、116.09％.结论 蓝莓花青素可以有效抑制H2O2诱导产生的视网膜细胞氧化损伤,其中主成分锦葵色素及其糖苷发挥重要作用.

目的:探讨当归挥发油对人肺腺癌GLC-82细胞增殖及凋亡的作用.方法:MTT比色法检测当归挥发油对GLC-82细胞的细胞毒作用;流式细胞术检测GLC-82细胞凋亡;吖啶橙/溴化乙锭(AO/BE)双荧光染色法观察GLC-82细胞凋亡.结果:当归挥发油在浓度6.25 ～ 200 μg/mL范围内对GLC-82细胞的增殖具有浓度依赖性抑制作用,对GLC-82细胞的IC5o为113.03 μg/mL.流式细胞术检测结果表明,当归挥发油可诱导GLC-82细胞凋亡、坏死,且细胞凋亡、坏死率随药物浓度增高而升高.AO/BE双荧光染色法结果显示,用药组随着药物浓度的升高,细胞结构固缩加重,凋亡、坏死细胞增多.结论:当归挥发油具有诱导GLC-82细胞凋亡的作用.

目的 建立介导胶原糖基化Glcα1、2Galβ1修饰基因(GLT25D1)敲低小鼠模型,为研究其在肝脏疾病中的作用奠定基础.方法 基于Cre-loxp重组酶系统,采用胚胎干细胞线性打靶技术,获得同源重组的干细胞,繁殖嵌合体,获得杂合子GLT25D1+/-小鼠.随后将GLT25D1+/-小鼠自交.通过PCR凝胶电泳技术对子代小鼠的基因型进行鉴定.采用Western blot技术检测GLT25D1在WT型小鼠(wild type,WT)和杂合子GLT25D1+/-小鼠各组织的表达.比较WT和GLT25D1+/-小鼠的生育情况、子代小鼠基因型比例及出生20天的体重差异.结果 GLT25D1+/-小鼠配笼繁殖的264只子代小鼠中,杂合子GLT25D1+/-小鼠152只,WT小鼠112只,无GLT25D1-/-小鼠.GLT25D1+/-小鼠数量和WT小鼠数量的比值低于孟德尔遗传定律的2:1(χ2=9.818,P=0.002).Western blot示GLT25D1蛋白在WT小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等重要组织中均有表达,其中在肝、脾和肺中高表达,肾和淋巴结中度表达,心和脑弱表达,GLT25D1+/-小鼠各组织表达水平均低于WT型小鼠.WT和GLT25D1+/-小鼠在外观和行为上无显著差异,GLT25D1+/-小鼠出生后20天体重显著低于WT型小鼠(t=2.520,P=0.0177).GLT25D1+/-小鼠交配后平均每窝出生的鼠仔数目为4只,低于WT小鼠平均鼠仔数7只(t=-8.482,P<0.001).结论 GLT25D1基因敲低后会导致GLT25D1-/-胚胎致死,且影响部分GLT25D1+/-小鼠正常出生,GLT25D1+/-小鼠出生后20天体重减轻,繁殖能力下降.

目的 从赤芝Ganoderma lucidum中提取、分离和纯化获得碱提多糖组分,在表征其基本理化性质和精细结构的基础上,对其体外免疫调节活性进行研究.方法 赤芝子实体干燥粉碎后,利用碱提醇沉法提取粗多糖,经Q-Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱纯化得到灵芝多糖组分(LZJ-0.15).采用PMP柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)及高效凝胶渗透色谱-十八角度激光光散射联用法(HPGPC-MALLS)测定LZJ-0.15的单糖组成及相对分子质量特征,并通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)及二维谱(1H-1H COSY和1H-13C HSQC)对LZJ-0.15的精细结构进行表征.采用小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红实验对灵芝多糖LZJ-0.15进行免疫活性评价.结果 LZJ-0.15的相对分子质量、分子半径及Mw/Mn分别为24 700、46.6 nm和1.019,其单糖组成分析显示以葡萄糖为主(92.3％),核磁谱图显示LZJ-0.15为→3) G1c(β1→及→6)Glc(β1→连接为主的葡聚糖.RAW264.7细胞吞噬中性红实验显示LZJ-0.15具有较好的免疫调节活性.结论 赤芝碱提灵芝多糖相较于水提多糖组分具有较优的免疫活性,有望开发成重要的免疫调节剂.

[背景]灵芝是一种广受关注的药食两用真菌,在中国作为传统药材和健康食品已有几千年历史,近年来中国人工栽培灵芝规摸扩展迅速,而多糖被认为是灵芝中最主要的活性成分.[目的]分离和纯化人工栽培灵芝子实体多糖,并对其结构和免疫调节活性进行研究.[方法]采用水提醇沉法提取灵芝子实体多糖(GLP),采用DE-52纤维素柱和SephadexG-100进行多糖的分离纯化,高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量,1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮(PMP)柱前衍生法测定单糖组成,红外光谱进行结构分析,噻唑蓝(MTT)比色法测定多糖对小鼠脾细胞增殖的影响,同时评价其对RAW264.7细胞吞噬能力和细胞因子分泌能力的促进作用.[结果]GLP平均分子量为1.93×104 Da,单糖组成包含葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)及甘露糖(Man),占比为Glc:Gal:Man=3.3:1.3:1.0.红外光谱显示,GLP的异头碳为β构型.GLP能直接促进脾细胞的增殖,且能显著增强刀豆蛋白A(ConA)诱导的T淋巴细胞和脂多糖(LPS)诱导的B淋巴细胞的增殖.此外,对于RAW264.7细胞的吞噬能力及细胞因子分泌具有一定的促进作用.[结论]灵芝多糖可作为一个潜在的免疫调节药物而开发利用.