钙离子结合蛋白S100A8和S100A9形成的异质二聚体复合物，又称钙保护素，是一种主要由中性粒细胞表达的多功能蛋白，介导广泛的生理和病理反应。笔者对S100A8/A9的炎症调控作用及其在呼吸道感染性疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病、呼吸机引起肺损伤中的作用进行阐述，探讨其作为诊断、预后判断指标及干预靶点的可能性。

目的 阐明过表达GATA2对鸡前脂肪细胞转录表达的影响.方法 培养鸡前脂肪细胞ICP1,转染pCMV-myc-GATA2 或 pCMV-myc 质粒,Western blot 验证细胞中 GATA2过表达情况,RNA-seq研究过表达GATA2对细胞转录组表达变化,ChIP-seq研究GATA2在基因组的结合情况,Real-time PCR验证部分差异表达基因、ChIP-PCR验证GATA2对TAF3基因的集合情况.结果 转染pCMV-myc-GATA2可以在ICP1细胞过表达GATA2蛋白,过表达GATA2后,ICP1细胞中942个基因表达上调,840个基因表达下调(P＜0.05),富集分析显示差异表达基因与核糖体和线粒体的结构和功能相关(P＜0.01);GESA分析显示,过表达GATA2的ICP1细胞中 RNA聚合酶Ⅱ转录起始复合物、核糖体生物生成、丙酸代谢和氧化磷酸化相关基因集表达上调;组蛋白赖氨酸N甲基转移酶、核转录抑制复合体形成、脂肪因子和钙离子等信号通路相关基因集表达下调.ICP1细胞中ChIP-seq鉴定出2 833个GATA2结合的基因组峰,涉及2 018个基因.Motif分析显示GATA2结合(T/A)GATA模序;富集分析显示这些基因参与胚胎发育、信号传导、细胞代谢和细胞间相互作用.差异表达基因和GATA2结合基因取交集获得105个基因,富集分析显示这些基因与转录、转录后调控、细胞间相互作用、信号传导和细胞周期相关(P＜0.001).结论 GATA2可以与鸡前脂肪细胞的基因组结合调节其转录组表达模式.

目的 分离并鉴定旋毛虫新生幼虫分泌的细胞外囊泡(EV)主要成分,了解新生幼虫EV的功能.方法 消化旋毛虫保种小鼠肌肉,手机旋毛虫肌幼虫,昆明小鼠灌胃感染肌幼虫(2 000条/鼠)后5d取小肠,网筛法收集旋毛虫成虫,成虫置于RPMI 1640培养液中培养48 h后收集新生幼虫.采用差速超速离心法提取旋毛虫新生幼虫培养液中的EV,透射电子显微镜观察EV形态,使用纳米颗粒跟踪分析技术检测EV的粒径,蛋白质免疫印迹(Western blotting)验证EV蛋白.对新生幼虫及其EV进行蛋白组质谱分析和miRNA测序分析,采用t检验比较新生幼虫及其EV之间蛋白和miRNA的表达差异.差异表达蛋白和miRNA靶基因进行基因本体论(GO)功能条目富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.使用WoLFPSORT分析蛋白的亚细胞定位.结果 透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析结果显示,旋毛虫新生幼虫分泌的EV为"杯盘"形膜性囊泡,平均粒径为(101.7±1.8)nm.Western blotting结果显示,新生幼虫EV能与旋毛虫感染小鼠血清产生特异性条带,相对分子质量约为65 000.蛋白组质谱分析结果显示,新生幼虫及其EV样品中分别检测到1424和231种蛋白,有220种蛋白在两组样品中均有表达,其中116种表达有差异(在EV中31种表达上调、85种表达下调).蛋白亚细胞定位分析结果显示,差异蛋白主要分布于细胞质(30.2％,35/116)、细胞核(19.0％,22/116)和细胞膜(17.2％,20/116).miRNA测序结果显示,新生幼虫及其EV样品分别检测到183和117种miRNA,有46种miRNA在两组样品中均有表达,其中40种表达有差异(在EV中10种表达上调、30种表达下调).在EV中表达上调的10种miRNA中,let-7-5p表达最高.GO功能条目富集分析结果显示,差异蛋白有57种属于细胞组成、73种具有分子功能、63种参与生物过程,差异miRNA的靶基因主要与自噬相关12基因转移酶活性、胞质泛素连接酶复合物、细胞对紫外线A的响应和钙离子稳态等条目有关.KEGG通路富集分析结果显示,差异蛋白主要富集在代谢途径、内质网中的蛋白质加工等相关通路,差异miRNA的靶基因仅涉及自噬-其他1条途径.结论 本研究分离并鉴定了旋毛虫新生幼虫分泌的EV,检测到新生幼虫及其EV间差异表达的116种蛋白和40种miRNA,主要参与代谢、自噬等途径,推测新生幼虫EV可能在旋毛虫感染早期逃避宿主免疫防御的过程中发挥重要作用.

突触结合蛋白(synaptotagmin,Syt)家族通常被认为在神经元突触相关Ca2+信号介导的突触间膜融合事件中起到非常重要的作用.既往研究已明确人类一共有17种不同亚型的突触结合蛋白,大多数突触结合蛋白作为钙离子传感器的作用也已经被揭示,其中Syt 1、2、7、9这四种蛋白均与突触膜融合事件有密切联系,并且参与构成可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)蛋白与SM(Sec1/Munc18)蛋白构成的复合物,与其相关的研究最为深入.在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中,神经细胞的功能,包括信号传递、突触释放、递质调节等,都依赖于突触结合蛋白之间的相互作用与协同调节.该综述旨在总结突触结合蛋白部分生理作用以及在神经系统疾病中的研究进展,提供其相互关联,为后续研究提供思路.

本研究旨在探讨Ca2+感受蛋白经典瞬时感受器电位蛋白1 (canonical transient receptor potential channel 1,TRPCl)与钙释放激活钙通道调节分子1 (calcium release-activated calcium modulator 1,Orail)的相互作用在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)钙敏感受体(Ca-sensing receptor,CaR)介导的Ca2+内流和一氧化氮(NO)生成中的作用.取2～3代HUVECs,单独或联合用CaR激动剂精胺[Spermine,激活钙库活化的钙通道(store-operated calcium channels,SOC)和受体活化的钙通道(receptor-operated calcium channels,ROC)]、ROC模拟剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)+CaR负性变构调节剂Calhex231(阻断SOC,激活ROC)、PKC抑制剂Ro31-8220(激活SOC,阻断ROC)以及经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967(激活SOC,阻断ROC)处理.用免疫荧光技术检测HUVECs中TRPC1和Orai1的蛋白表达、共定位;用免疫共沉淀法检测TRPC1和Orai1之间的相互作用模式;随后用TRPC1和Orai干扰质粒联合转染HUVECs,采用荧光探针同时检测HUVECs中[Ca2+]i和NO生成的变化.结果显示,HUVECs中TRPC1和Orai1蛋白表达共定位于胞膜.与Spermine+Ca2+组相比,Calhex231+TPA+Spermine+Ca2+组、Ro31-8220+Spermine+Ca2+组和Go6976+Spermine+Ca2+组HUVECs中定位于胞浆中的TRPC1、Orai1蛋白表达均显著降低,二者的结合也减少.免疫共沉淀结果显示,Calhex23 1+TPA+Spermine+Ca2+组、Ro31-8220+Spermine+Ca2+组和Go6976+Spermine+Ca2+组TRPC 1/Orai1和Orai 1/TRPC1相对比值百分数均明显低于对照组以及Spermine+Ca2+组(均P＜0.05),表明Orai1和TRPC1相互作用均减弱.联合转染质粒敲低TRPC1和Orai1显著降低Spermine+Ca2+组、Calhex231+TPA+Spermine+Ca2+组、Ro31-8220+Spermine+Ca2+组和Go6976+Spermine+Ca2+组的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成.以上结果提示,TRPC1与Orai1以二元复合物的形式激活SOC和ROC,介导Ca2+内流及NO生成.

朊病毒病是一类具有致死性、传染性和进行性的神经退行性疾病.目前研究发现许多因子都参与了疾病的发生发展过程,包括细胞因子、激酶和一些离子,其中钙离子及相关激酶在朊病毒病致病机制中的研究报道较少,为了探究朊病毒感染中钙调蛋白相关下游激酶的含量变化情况,本研究利用多种检测方法对朊病毒感染细胞系及小鼠脑组织进行了分析.结果显示朊病毒感染后,钙离子和钙调蛋白(CaM)的表达水平升高,下游Ca2/CaM复合物依赖性激酶CaMKIα和CaMKIV表达水平下降,同时这些激酶的上游激酶CaMKKα含量降低,提示朊病毒感染后神经元中钙离子和相关激酶稳态失衡,这种异常变化很可能影响下游多种转录因子合成,这些结果为解释朊病毒感染后神经元大量丢失提供了科学依据.

1 材料与方法120只成年雄性SD大鼠来源于陆军军医大学实验动物中心,将大鼠分为正常组、烧伤组、烧伤+肠三叶因子(ITF)组,每组40只.所有大鼠均给予剔除躯干毛发,苯巴比妥钠麻醉,2个烧伤组大鼠造成30％ TBSAⅢ度烧伤.钙离子螯合法提取肠上皮细胞(IECs),镁离子梯度离心法制备IECs刷状缘囊泡(BBMVs).采用透射电镜观察BBMVs结构变化,核素液相闪烁仪检测IECs及BBMVs对谷氨酰胺的转运能力.采用蛋白质印迹法检测IECs中ASCT2和B0AT1及其相关调控蛋白磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、p-62、LC3-Ⅱ、二硫键异构酶(PDI)蛋白水平的变化.采用荧光定量PCR技术观察IECs中ASCT2、B0AT1、CHOP、GRP78、PDI mRNA水平的变化.采用PDI亚硝基化实验和胰岛素聚集实验检测PDI的活性变化.体外实验培养IEC-.6细胞株,分为正常血清组、烧伤血清组、烧伤给药组、烧伤给药后抑制AMPK组、烧伤给药后抑制自噬组、烧伤给药后抑制PDI组,正常血清组细胞加入体积分数10％正常大鼠血清培养,5个烧伤组细胞均加入体积分数10％烧伤大鼠血清培养,后4组细胞还分别加入ITF(10 μg/mL,质量浓度下同)培养、ITF+复合物C培养、ITF+ 3-MA培养、ITF+16F16培养.检测前述蛋白表达.采用双向方差分析统计数据,P ＜0.05为差异有统计学意义.

为了探讨牦牛适应高海拔低氧环境的基因表达特征与规律,对在高海拔(3 560 m)和低海拔(478 m)地区饲育4个月的2.5 ～3岁健康雄性麦洼牦牛肺组织进行转录组测序.转录组测序采用Illumina高通量测序平台(HiSeqTM2500/4000)进行,并以qRT-PCR验证差异表达基因的表达量.结果 显示,高海拔组牦牛肺脏转录组平均每个测序样本得到约5.76亿条Clean Reads,低海拔组牦牛得到约6.10亿条Clean Reads,比对到参考基因组上的Reads数分别占91.74％和91.28％以上,共发现了2 047个新转录本.低海拔组与高海拔组牦牛肺脏组织之间共有199个差异表达基因,其中含89个差异上调表达基因和110个差异下调表达基因.所得差异表达基因富集在297个GO条目和146个KEGG通路中,包含62个低氧适应相关的GO条目和35个低氧适应相关代谢通路.其中低氧适应相关GO条目在生物过程、细胞组成和分子功能三种类别中占比最多的分别为细胞粘附、蛋白复合物和钙离子结合.低氧适应相关KEGG通路中占比最多的为肿瘤坏死因子(TNF)信号通路,其次为低氧诱导因子1(HIF-1)信号通路.qRT-PCR验证结果显示,Ⅱ类人类白细胞抗原α链(HLA-DOA、HLA-DRA)、补体因子(C2)和甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)基因的表达量变化与转录组测序结果相符.本研究为全局和深入理解牦牛肺组织转录本表达对高海拔低氧的响应提供了有价值的切入点.

目的 探讨山奈酚(kaempferol,Kae)对周期性单轴牵张力下小鼠骨髓间充质细胞(bone marrow mes-enchymal cells,BMMCs)成骨分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin com-plex 1,mTORC1)信号通路的作用.方法 对体外分离培养的小鼠BMMCs施加形变量10％的单轴动态牵张力,通过细胞毒性试验筛选出合适浓度Kae,并添加工具药pp242改变内源性mTOR信号,在牵张后4 h利用化学比色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化、ELISA法检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达量,流式细胞仪检测细胞内钙离子相对含量;利用Western Blot检测内源性mTORC1信号通路主要分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal proteinS6 kinases,S6K)、4E/BP1的磷酸化表达及成骨转录因子Runx2和Osterix的表达变化,qRT-PCR检测上述因子mRNA表达水平.结果 10μmol/L Kae对细胞的抑制作用较小,且成骨能力最强.加力结束后4 h,Kae能够有效促进BMMCs成骨分化,ALP表达为(153.04±18.72)U/mg,OCN表达为(1.64±0.25)U,成骨转录因子Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白水平表达上调,细胞内钙离子含量下降,同时mTORC1信号通路中mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调;在加入pp242抑制mTORC1信号表达后,mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,BMMCs成骨分化效应显著被抑制,Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白表达显著下调,ALP及OCN表达下调,细胞内钙离子含量增高.结论 Kae通过mTORC1信号通路促进牵张力下小鼠BMMCs成骨分化.

目的:基于生物信息学的方法探索骨关节炎(osteoarthritis,OA)的发病基因和潜在治疗药物.方法:利用网络基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)下载关于骨关节炎的芯片GSE55235、GSE12021和GSE55457.通过R语言软件分析获得差异表达基因(differentially expressed genes,DECs).通过DAVID在线数据库对DEGs进行GO富集分析和KEGG通路分析.利用String数据库对DEGs进行蛋白互作分析并通过Cytoscape软件进行可视化.通过连接图(connectivity map,cMap)数据库分析具有潜在治疗性OA的小分子药物.结果:共获得67个DEGs,其中18个基因表达上调,49个基因表达下调.GO分析表明,DEGs的生物学过程集中在细胞增殖、细胞黏附、机械刺激反应、成骨细胞分化和细胞对钙离子反应的调节上,参与细胞外空间、内质网膜和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等细胞组成.分子功能包括蛋白质同二聚化活性、生长因子活性、转录因子活性、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性结合、蛋白质异二聚化活性、过氧化物酶活性、MAP激酶酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性.KEGG通路分析表明,这些DEGs主要参与破骨细胞分化、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和Jak-STAT信号通路.从PPI网络中鉴定出前10个中枢基因是IL-6、JUN、VEGFA、ATF3、DUSP1、MYC、PTGS2、JUNB、CDKN1A和CD44.还筛选了一些用于治疗OA的潜在小分子药物,如雌二醇和来氟米特.结论:所选择的关键基因可能是OA的诊断标志物和潜在治疗靶点,所选择的小分子药物可能是治疗OA的潜在治疗药物.