目的:探讨蛆虫清创疗法(MDT)促进糖尿病足溃疡(DFU)患者创面血管新生的机制。方法:(1)将东部战区空军医院2018年6月—2019年6月收治的符合入选标准的12例应用MDT(疗程为3 d)的DFU患者[男6例、女6例，年龄(56±12)岁]、12例无糖尿病的急性外伤患者[男6例、女6例，年龄(53±10)岁]分别设为DFU组与外伤无糖尿病组。应用MDT前后观察DFU组患者创面大体情况并留取创面组织，留取外伤无糖尿病组患者首次就诊时清创前创面组织，采用免疫组织化学法检测DFU组患者应用MDT前后创面组织中血管新生标志物CD31的表达，分别采用蛋白质印迹法、实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测DFU组患者应用MDT前后及外伤无糖尿病组患者清创前创面组织中脂肪酸合成酶(FAS)的蛋白、mRNA表达。(2)用含体积分数10%胎牛血清的内皮细胞培养基体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，取第3～6代对数生长期细胞进行以下实验。取3 d龄无菌丝光绿蝇幼虫，提取分泌排泄物(ES)用于后续实验。取3个批次细胞，均分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、单纯高糖组、高糖＋5 μg/mL蛆虫ES组和高糖＋10 μg/mL蛆虫ES组，分别加入PBS、终物质的量浓度20 mmol/L葡萄糖、终物质的量浓度20 mmol/L葡萄糖＋终质量浓度5 μg/mL蛆虫ES、终物质的量浓度20 mmol/L葡萄糖＋终质量浓度10 μg/mL蛆虫ES处理，各组试剂总体积相同。培养48 h，分别采用蛋白质印迹法、实时荧光定量RT-PCR法和免疫荧光法检测各批次细胞中FAS的蛋白、mRNA表达情况及细胞内FAS蛋白表达与定位情况，其中mRNA表达样本数为3。(3)取2个批次细胞，均分为单纯小干扰RNA(siRNA)对照组、siRNA对照＋蛆虫ES组、siRNA-FAS＋蛆虫ES组，分别转染终物质的量浓度为100 μmol/L的无意义对照siRNA、无意义对照siRNA、siRNA-FAS 4～6 h，之后分别加入PBS、终质量浓度10 μg/mL蛆虫ES、终质量浓度10 μg/mL蛆虫ES常规培养24 h，各组试剂的总体积相同。1个批次细胞进行划痕试验，划痕后24 h观察划痕宽度，检测细胞迁移能力；1个批次细胞进行成管实验，培养24 h后观察细胞小管生成情况。划痕试验和成管实验样本数均为3。对数据行 t检验、单因素方差分析、LSD检验、重复测量方差分析及Bonferroni法。 结果:(1)与应用MDT前比较，DFU组患者应用MDT后创面新鲜肉芽组织明显增多，坏死组织明显减少；创面组织中CD31表达明显增多。DFU组患者应用MDT前创面组织中FAS蛋白表达较外伤无糖尿病组清创前明显减少，DFU组患者应用MDT后创面组织中FAS蛋白表达较应用MDT前明显增多。DFU组患者应用MDT前创面组织中FAS mRNA表达量为1.00±0.17，较外伤无糖尿病组清创前的3.87±1.02明显减少( t＝9.808， P<0.01)；DFU组患者应用MDT后创面组织中FAS mRNA表达量为1.85±0.31，较应用MDT前明显增多( t＝-10.853， P<0.01)。(2)培养48 h，蛋白质印迹法检测显示，单纯高糖组细胞中FAS蛋白表达较PBS对照组明显减少，高糖＋5 μg/mL蛆虫ES组、高糖＋10 μg/mL蛆虫ES组细胞中FAS蛋白表达较单纯高糖组明显增多。实时荧光定量RT-PCR法检测显示，单纯高糖组细胞中FAS mRNA相对表达量为0.392±0.073，较PBS对照组的1.000±0.085明显减少( P<0.01)；高糖＋5 μg/mL蛆虫ES组和高糖＋10 μg/mL蛆虫ES组细胞中FAS mRNA相对表达量分别为0.561±0.047、0.687±0.013，组间比较差异有统计学意义( P<0.05)，且均较单纯高糖组显著增多( P<0.01)。免疫荧光法检测结果显示，各组细胞内FAS蛋白主要定位在细胞质中，表达情况与蛋白质印迹法检测结果相近。(3)划痕后24 h，siRNA对照＋蛆虫ES组、siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞划痕未愈合宽度明显窄于单纯siRNA对照组( P<0.01)，siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞划痕未愈合宽度明显宽于siRNA对照＋蛆虫ES组( P<0.01)。培养24 h，siRNA对照＋蛆虫ES组、siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞小管生成数明显多于单纯siRNA对照组( P<0.05或 P<0.01)，siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞小管生成数明显少于siRNA对照＋蛆虫ES组( P<0.05)。 结论:MDT通过蛆虫ES上调FAS的表达水平促进血管内皮细胞活力，从而促进DFU患者创面血管新生。

目的 分离并鉴定旋毛虫新生幼虫分泌的细胞外囊泡(EV)主要成分,了解新生幼虫EV的功能.方法 消化旋毛虫保种小鼠肌肉,手机旋毛虫肌幼虫,昆明小鼠灌胃感染肌幼虫(2 000条/鼠)后5d取小肠,网筛法收集旋毛虫成虫,成虫置于RPMI 1640培养液中培养48 h后收集新生幼虫.采用差速超速离心法提取旋毛虫新生幼虫培养液中的EV,透射电子显微镜观察EV形态,使用纳米颗粒跟踪分析技术检测EV的粒径,蛋白质免疫印迹(Western blotting)验证EV蛋白.对新生幼虫及其EV进行蛋白组质谱分析和miRNA测序分析,采用t检验比较新生幼虫及其EV之间蛋白和miRNA的表达差异.差异表达蛋白和miRNA靶基因进行基因本体论(GO)功能条目富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.使用WoLFPSORT分析蛋白的亚细胞定位.结果 透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析结果显示,旋毛虫新生幼虫分泌的EV为"杯盘"形膜性囊泡,平均粒径为(101.7±1.8)nm.Western blotting结果显示,新生幼虫EV能与旋毛虫感染小鼠血清产生特异性条带,相对分子质量约为65 000.蛋白组质谱分析结果显示,新生幼虫及其EV样品中分别检测到1424和231种蛋白,有220种蛋白在两组样品中均有表达,其中116种表达有差异(在EV中31种表达上调、85种表达下调).蛋白亚细胞定位分析结果显示,差异蛋白主要分布于细胞质(30.2％,35/116)、细胞核(19.0％,22/116)和细胞膜(17.2％,20/116).miRNA测序结果显示,新生幼虫及其EV样品分别检测到183和117种miRNA,有46种miRNA在两组样品中均有表达,其中40种表达有差异(在EV中10种表达上调、30种表达下调).在EV中表达上调的10种miRNA中,let-7-5p表达最高.GO功能条目富集分析结果显示,差异蛋白有57种属于细胞组成、73种具有分子功能、63种参与生物过程,差异miRNA的靶基因主要与自噬相关12基因转移酶活性、胞质泛素连接酶复合物、细胞对紫外线A的响应和钙离子稳态等条目有关.KEGG通路富集分析结果显示,差异蛋白主要富集在代谢途径、内质网中的蛋白质加工等相关通路,差异miRNA的靶基因仅涉及自噬-其他1条途径.结论 本研究分离并鉴定了旋毛虫新生幼虫分泌的EV,检测到新生幼虫及其EV间差异表达的116种蛋白和40种miRNA,主要参与代谢、自噬等途径,推测新生幼虫EV可能在旋毛虫感染早期逃避宿主免疫防御的过程中发挥重要作用.

目的 比较并分析旋毛虫成虫期及新生幼虫期丝氨酸蛋白酶基因和蛋白的结构及功能.方法 应用NCBI、EMBL、MEGA、ExPasy 、TMHMM、SignalP、PROSITE、Coils、SYFPEITHI等多种在线生物信息学网站和软件,对旋毛虫成虫期和新生幼虫期丝氨酸蛋白酶基因(Zh68和T668)的同源性、系统发育进化状况进行分析,并预测相应蛋白(SP1和SP2)的基本理化性质、跨膜区、motif、结构域、亚细胞定位、二级及三级结构、细胞抗原表位等.结果 Zh68和T668为旋毛虫特有基因,但核苷酸同源性仅为48％,SP1和SP2的氨基酸同源性为27.5％.SP1和SP2均为不稳定的亲水性蛋白,N-末端均有一个信号肽的分泌蛋白;二级及三级结构类似,并预测出两者最佳B及T细胞抗原表位,但SP2有一个跨膜螺旋结构,为膜蛋白.结论 旋毛虫成虫期的SP1是非跨膜蛋白,可能参与虫体在肠道寄生及发育、繁殖;新生幼虫期的SP2是跨膜蛋白,可能参与虫体的入侵及迁移.

目的 研究盐酸环丙沙星去除肠道细菌对家蝇生长、发育和繁殖的影响.方法 将家蝇初产卵置于0.1％、0.3％和0.5％的盐酸环丙沙星浸泡的滤纸上,观察卵的孵化率,以无菌水浸泡的滤纸为对照;孵化后幼虫分别提供含0.1％、0.3％和0.5％的盐酸环丙沙星饲料,每天观察家蝇各虫态的发育情况,计算家蝇各虫态的发育历期,以提供不含盐酸环丙沙星饲料的家蝇为对照.羽化后的家蝇雌、雄成虫分别配对饲养,并提供红糖补充营养,另提供含0.1％、0.3％和0.5％盐酸环丙沙星的饮水,以提供不含盐酸环丙沙星饮水的家蝇为对照,分别计算其产卵前期、单雌产卵量和成虫寿命.利用特定年龄两性生命表软件,计算家蝇特定年龄存活率、生殖力和单雌产卵量,种群的内禀增长率、周限增长率和净增值率,评估盐酸环丙沙星对家蝇个体发育和种群增长的影响.利用SPSS 20.0软件进行统计学分析,组间比较采用单因素方差分析,独立样本两两比较采用￡检验.结果 喂食0.1％、0.3％和0.5％盐酸环丙沙星后,家蝇卵期和蛹期分别约为1和6d,与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);对照组和喂食0.1％、0.3％、0.5％盐酸环丙沙星家蝇幼虫的发育历期由(5.80±0.09)d延长至(8.44±0.06)d,对照组与不同剂量间差异均有统计学意义(F=308.981,P=0.000);对照组和喂食0.1％、0.3％、0.5％盐酸环丙沙星的家蝇雌成虫寿命由对照组家蝇的(28.39±0.92)d下降至(17.19±0.85)d,雄虫寿命由(26.27±1.12)d下降至(17.31±0.98)d,对照组与不同剂量间差异均有统计学意义(雌虫F=20.091,P=0.000;雄虫F=14.218,P=0.000).对照组和喂食0.1％、0.3％、0.5％盐酸环丙沙星的家蝇雌虫产卵前期由(4.94±0.10)d延长至(6.37±0.33)d,单雌产卵量由(638.76±39.32)粒下降至(137.37±24.22)粒,对照组与不同剂量间差异均有统计学意义(F=28.336,P=0.000).特定年龄两性生命表研究表明,对照组家蝇和0.1％、0.3％、0.5％盐酸环丙沙星处理后家蝇卵的孵化率由96.43％下降至68.75％,家蝇整个发育阶段的死亡率由15.48％上升至46.09％.新生卵的期望寿命由36.07 d下降至18.03 d,雌虫的期望寿命由32.03 d下降至19.88 d.从种群生态学角度来说,对照组和0.1％、0.3％、0.5％盐酸环丙沙星处理后家蝇种群的内禀增长率由0.23下降至0.13,局限增长率由1.26下降至1.14,净增长率由258.55下降至28.98.结论 喂食盐酸环丙沙星后,家蝇的个体发育迟缓,生殖力指标下降,种群增长受到显著抑制.

[目的]探讨异尖线幼虫感染IgE抗体阳性与高危妊娠的相关性.[方法]选择2017年1月至2019年12月在本院诊治的高危妊娠孕妇738例(观察组),另外选择同期在本院产检健康孕妇500例作为对照组.采集所有孕妇的静脉血,检测其血清特异性异尖线幼虫IgE抗体,并分析孕妇血清IgE抗体阳性的影响因素及与高危妊娠的相关性.[结果]观察组IgE抗体阳性率为24.8％(183/738),显著高于对照组的20.0％ (100/500),其差异有统计学意义(P ＜0.05);IgE阳性组孕妇的平均年龄显著大于IgE阴性组,顺产比例、初产比例显著低于IgE阴性组,产后住院时间显著长于IgE阴性组,妊娠期间检查次数显著少于IgE阴性组.孕妇分娩的新生儿中,IgE阳性组孕妇所产的新生儿体质量、胎龄均显著小于IgE阴性组,新生儿监护病房(NICU)患儿比例显著高于IgE阴性组.高危妊娠是孕妇异尖线幼虫感染IgE抗体阳性的独立危险因素.[结论]高危妊娠是孕妇异尖线幼虫感染IgE抗体阳性的独立危险因素,影响妊娠结局.

肝泡型包虫病是一种较为罕见的人兽共患性寄生虫疾病,是由多房棘球绦虫的幼虫在中间宿主肝内不断增殖而引起的一种肝脏疾病.病变早期常无明显临床症状,发现时往往已属晚期.对于治疗现主要依靠根治性手术,目前要求切除病灶边缘1 cm以上的组织[1].但由于病灶无包膜,与周围肝脏组织分界模糊,只能依靠术中肉眼分辨其边界,可能造成术后病灶残留或者损伤重要胆道和血管增加手术创伤.肝泡型包虫病"边缘带"指病灶与周围正常肝组织之间的组织,其范围大小及内在生物学特性对肝泡型包虫病的治疗有重要指导意义.本文对肝泡型包虫病边缘带的生物学特性及临床意义做一综述.

目的 用聚合纳米金棒标记的巯基化旋毛虫排泄分泌抗原构建旋毛虫感染早期敏感的诊断方法.方法 制备旋毛虫成虫、新生幼虫、囊包幼虫的粗抗原和纯化抗原,以及肌幼虫排泄分泌抗原.优化金晶种子生长法中的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、抗坏血酸(AA)和硝酸银(AgNO3)的用量,制备出长径比稳定的纳米金棒,与不同浓度(10、20、30、40、50μg/ml)巯基化的旋毛虫排泄分泌抗原、虫体粗抗原以及虫体纯化抗原结合进行纳米金棒的功能化,通过观察紫外分光扫描表面等离子共振吸收峰的变化,筛选标记的最适浓度和诊断抗原.用纳米金棒标记最适诊断抗原,分别检测不同囊包幼虫感染度(轻、中、重度分别感染50、100、300条/鼠)小鼠感染后5、8、11、17、23 d的血清抗体以及重度感染的小鼠不同血清稀释度(1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1∶700、1∶800)的血清抗体情况,并与包被最适诊断抗原的ELISA法检测结果进行评价性比较,判定其检测早期低虫荷时的敏感性.结果 11.875 ml 0.2 mol/L CTAB、160μl 100 mmol/L AA和150μl 10 mmol/L AgNO3制备出的纳米金棒径长比最长,溶液最稳定.用纳米金棒标记的不同浓度旋毛虫粗抗原、纯化抗原以及排泄分泌抗原,紫外分光光度计光谱显示表面等离子共振吸收峰位移最大值为87 nm,最适包被抗原为排泄分泌抗原.用纳米金棒标记的旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原能检出轻度、中度、重度感染囊包幼虫后5d小鼠的血清抗体以及稀释度为1∶800的阳性血清抗体.ELISA法能检出轻度和中度感染囊包幼虫后11d小鼠的血清抗体和重度感染囊包幼虫后8d小鼠的血清抗体以及稀释度为1∶600的阳性血清抗体.结论 纳米金棒能够有效标记旋毛虫抗原,排泄分泌抗原功能化的纳米金棒对旋毛虫早期感染及低虫荷的诊断具有明显优势.

目的 克隆表达旋毛虫钙网蛋白(TsCRT),并对其生物学特性进行鉴定.方法 通过RT-PCR扩增TsCRT基因,构建重组质粒pMD19T-TsCRT,测序正确后亚克隆至表达载体pQE80L,构建重组表达载体pQE80L-TsCRT,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过Western blot、qPCR和免疫荧光试验(IFT)鉴定rTsCRT的反应原性及其在不同虫期的表达与组织定位,通过动物免疫试验观察rTsCRT的免疫原性.结果 成功构建重组表达载体pQE80L-TsCRT,转化DE3后经IPTG诱导表达相对分子质量为47×103的rTsCRT蛋白.用纯化的rTsCRT免疫小鼠3次,血清抗体效价达1 ∶105.Western blot显示,rTsCRT可被抗rTsCRT血清和旋毛虫感染小鼠血清识别.qPCR检测显示,TsCRT在旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫、成虫和新生幼虫期均有转录和表达.IFT试验显示,TsCRT主要定位在旋毛虫的表皮和胚胎中.结论 TsCRT在旋毛虫不同虫期均有表达,重组表达的rTsCRT具有良好的抗原性,可作为制备抗旋毛虫疫苗及血清学诊断的候选靶抗原.

目的 鉴定能被旋毛虫感染血清识别的新生幼虫蛋白,为抗新生幼虫疫苗筛选候选抗原.方法 从感染旋毛虫的BALB/c小鼠肠道收集成虫,培养后收集新生幼虫,制备新生幼虫可溶性性抗原,通过蛋白质免疫印迹(Western blotting)筛选出能被旋毛虫感染小鼠血清识别的新生幼虫可溶性抗原蛋白带进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定,并与Uniprot数据库中的旋毛虫数据进行比对,利用生物信息学在线网站分析所鉴定的旋毛虫蛋白的理化性质,使用WEGO在线软件对匹配的蛋白进行基因本体(GO)分类.收集旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫(感染后6h)、成虫(感染后2d)和新生幼虫等不同发育期的虫体,提取虫体总RNA,反转录为cDNA.qPCR扩增旋毛虫C型凝集素(CTL)、钙网蛋白(CRT)、锌指蛋白(ZFP)和丙酮酸激酶(PK)基因,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参,以肌幼虫的相对转录水平为对照,比较4个旋毛虫基因在不同发育期的相对转录水平.不同发育期相对转录水平的比较采用单因素方差分析.结果 Western blotting结果显示,新生幼虫可溶性抗原的11条蛋白条带中有4条被旋毛虫感染血清识别,相对分子质量分别为Mr 99 700、79 600、68 900和46 000;LC-MS/MS鉴定出353种旋毛虫蛋白,其中166种蛋白(47.0％)为Mr40 000～70 000,182种蛋白(51.8％)的等电点为5～6,31种蛋白有信号肽,58种蛋白有跨膜结构域.GO分析结果显示,353种旋毛虫蛋白中,285种蛋白有功能注释,其中177种蛋白(62.1％)具有催化活性,192种蛋白(67.4％)具有结合活性,158种蛋白(55.4％)参与代谢过程,149种蛋白(52.3％)参与细胞转化过程.qPCR结果显示,以旋毛虫肌幼虫的相对转录水平为对照,肠道感染性幼虫、成虫和新生幼虫的CTL基因相对转录水平分别为140.99％、90.99％和65.71％(F=1 875.105,P＜0.01),CRT 基因分别为 79.33％、41.59％和 58.58％(F=2 192.665,P＜0.01),ZFP 基因分别为 64.93％、105.36％和 126.74％(F=475.836,P＜0.01),PK 基因分别为 73.93％、98.09％和 43.19％(F=1 373.743,P＜0.01).结论 鉴定获得能被旋毛虫感染血清识别的新生幼虫蛋白353种,其参与了旋毛虫生长发育、免疫逃避及侵袭宿主等过程,有可能成为抗新生幼虫疫苗的候选靶分子.