目的:探讨长基因间非蛋白质编码核糖核酸174(LINC00174)调控骨质疏松分子机制。方法:选择烟台山医院47例骨质疏松症患者和47例正常健康人为研究对象。人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)购自美国ScienCell公司。过表达LINC00174质粒(pcDNA-LINC00174)、过表达阴性对照(pcDNA-NC)、LINC00174小干扰RNA(si-LINC00174)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)转染至hBMSCs。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因信使核糖核酸(mRNA)表达；噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性；流式细胞仪检测细胞凋亡率；蛋白质印迹法检测蛋白表达；酶联免疫吸附法检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)水平。两组间比较行 t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:骨质疏松症患者血清中LINC00174表达水平显著高于健康对照(2.38±0.21比1.00±0.11)，差异有统计学意义( t＝39.908， P<0.05)。pcDNA-LINC00174组hBMSCs细胞LINC00174表达(3.01±0.25比1.00±0.08)、凋亡率[(23.25±1.42)%比(12.46±1.07)%]和活化的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved Caspase-3)表达(0.75±0.05比0.39±0.03)显著高于pcDNA-NC组，增殖活性(0.53±0.04比0.91±0.06)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、(0.42±0.05比0.86±0.06)、碱性磷酸酶(ALP)(0.37±0.03比0.65±0.05)、Runt相关转录因子2(RUNX2)(0.41±0.04比0.83±0.06)和骨钙蛋白(OCN)(0.27±0.03比0.72±0.05)蛋白表达显著低于pcDNA-NC组，差异有统计学意义( t＝15.671、20.877、9.564、12.431、17.498、21.652、18.932、21.774， P<0.05)。si-LINC00174组hBMSCs细胞LINC00174表达(0.38±0.04比1.01±0.09)、凋亡率[(8.46±0.78)%比(13.73±1.43)%]和cleaved Caspase-3(0.26±0.02比0.45±0.04)表达显著低于si-NC组，增殖活性(1.21±0.08比0.78±0.05)、Cyclin D1(0.78±0.06比0.54±0.04)、ALP(0.75±0.06比0.49±0.04)、RUNX2(0.89±0.06比0.53±0.05)和OCN(0.92±0.06比0.68±0.05)蛋白表达显著高于si-NC组，差异有统计学意义( t＝13.032、16.541、10.125、19.356、15.238、18.981、9.237、11.343， P<0.05)。pcDNA-LINC00174组hBMSCs细胞Nrf2(0.39±0.03比0.88±0.06)和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)(0.24±0.02比0.59±0.05)蛋白表达显著低于pcDNA-NC组，差异有统计学意义( t＝17.238、14.045， P<0.05)。si-LINC00174组hBMSCs细胞核因子红系2相关因子2(Nrf2)(0.94±0.05比0.72±0.04)和Keap1(0.86±0.05比0.47±0.04)蛋白表达显著高于si-NC组，差异有统计学意义( t＝13.032、16.541， P<0.05)。 结论:LINC00174可调控骨质疏松，其机制可能与通过Nrf2/Keap1信号通路调控hBMSCs增殖、成骨细胞分化、凋亡及氧化应激有关。

基于内质网应激(ERS)诱导的细胞凋亡探究骨松强骨方(GSQG)减轻去卵巢小鼠骨丢失的作用与机制.小鼠卵巢摘除(OVX)骨质疏松造模完成后,根据随机数字法,将 60 只小鼠随机分为 6 组:假手术组,模型组,骨松强骨方低(GSQG-L)、中(GSQG-M)、高剂量(GSQG-H)组,雌二醇(E2)组,每组10 只;切除双侧卵巢构建模型.术后1 个月开始灌胃给药,连续给药3 个月.酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清中骨形成指标骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原氨基端前肽(PINP)和骨吸收指标Ⅰ型胶原交联羧基端肽(CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶 5b(TRAcP-5b)的水平,使用Micro-CT观察股骨远端骨微结构的改变,HE染色观察骨组织形态,RT-qPCR检测胫骨干成骨相关基因Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子 2(Runx2)、骨唾液酸糖蛋白(BSP)、OCN以及破骨相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、活化T细胞核因子(NFATc1)和组织蛋白酶K(CATK)mRNA的表达,TUNEL染色、免疫组化检测骨细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹法检测胫骨近端骨组织ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白 78(Grp78)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、真核翻译起始因子 2α(eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、肌醇需求酶1α(IRE1α)、磷酸化IRE1α(p-IRE1α)、激活转录因子6(ATF6)的表达.结果显示,GSQG对去卵巢小鼠血清中OCN、PINP、TRAcP-5b、CTX骨代谢生化指标有明显改善,Micro-CT显示GSQG-H组股骨远端骨微结构明显优于其他组.与模型组比较,HE染色结果显示,GSQG-L组、GSQG-M组、GSQG-H组骨小梁明显变宽,数目增多,网状结构得到了一定程度的恢复,排列仍然整齐,部分间隙轻微增大;TUNEL阳性细胞显著减少(P<0.05,P<0.01);凋亡细胞相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、凋亡因子Bcl-2关联X蛋白(Bax)蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2 蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01);成骨相关基因Col-Ⅰ、ALP、Runx2、BSP和OCN mRNA表达显著升高(P<0.01),破骨相关基因TRAP、NFATc1 和CATK mRNA表达显著减少(P<0.05,P<0.01);ERS相关蛋白Grp78、p-PERK、p-eIF2、p-IRE1α、ATF6 表达显著降低(P<0.05,P<0.01),各给药组中以GSQG-H组最为显著.综上研究表明,GSQG能够通过抑制去卵巢小鼠胫骨近端骨组织Grp78/PERK/eIF2α/IRE1α/ATF6 信号通路,抑制骨细胞凋亡,从而有效减少去卵巢小鼠骨丢失.

目的 观察固本活血壮骨颗粒对糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)大鼠的作用与机制.方法 3月龄的Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、中药组及西药组.采用试剂盒分别检测大鼠血清骨代谢指标钙(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量;采用Micro-CT检测大鼠股骨骨密度(bone mine density,BMD)并分析骨小梁结构系数如骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨表面积组织体积比值(BS/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp);采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察各组大鼠股骨组织病理形态变化;采用蛋白印迹法(Western blot)检测股骨组织中磷酸化核转录因子 κB-p65(phospho-nuclear transcription factor-κB p65,p-NF-κB p65)、活化T细胞核因子蛋白1(recombinant nuclear factor of activated T-cell,NFATc1)、β-连环蛋白(β-catenin)的表达,采用逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测股骨组织中NFATc1、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)、β-catenin的mRNA表达.结果 固本活血壮骨颗粒提高GIOP大鼠血清Ca值、血清P值、BMD值、BV/TV值、Tb.Th值、BS/TV值和Tb.N值(P<0.05),降低血清ALP值与Tb.Sp值(P<0.05);改善骨组织中β-catenin、NFATc1、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白与mRNA表达(P<0.05).另外,固本活血壮骨颗粒对GIOP大鼠血清ALP、股骨NFATc1的调节作用比阿法迪三更具优势(P<0.05).结论 固本活血壮骨颗粒可拮抗GIOP,减少骨质丢失,其作用机制与Wnt/β-catenin通路和TRAF6/NF-κB p65/NFATcl信号通路有关.

我们通过阻断钙调磷酸酶(Cn)/活化T细胞核因子(NFAT)信号通路,探讨是否能减少磨损颗粒诱导的成骨细胞炎性因子分泌.一、材料与方法取新生SD大鼠头颅骨,经消化法获取成骨细胞.钛颗粒组:成骨细胞培养皿中加入钛颗粒(0.1 mg/ml,浓度、性状与体内磨损颗粒相似)共培养;钛颗粒/VIVIT肽组:成骨细胞培养皿中加入钛颗粒(0.1 mg/ml)和11R-VIVIT肽(2μmol/L,氨基酸编码:RRRRRRRRRRR-GGG-MAGPHPVIVITGPHEE)共培养;对照组中仅加入等量溶剂.细胞培养96h后取细胞行Western blot检测NFATc1蛋白表达,于6、24、96h离心后取细胞培养上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组白细胞介素(IL)-6和前列腺素E2 (PGE2)的含量.

目的:研究硫化氢(H2S)对心肌细胞肥大的负性调控作用与miRNA-133a介导Ca2+/CaN/NFATc4信号通路的关系.方法:异丙肾上腺素(ISO)诱导体外培养的大鼠心肌细胞肥大模型;Leica图像分析软件测量心肌细胞表面积;qRT-PCR检测脑钠尿肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、H2S合酶(CSE)、miRNA-133a和钙调神经磷酸酶(CaN)mRNA表达;Western blot检测CaN、活化T细胞核因子c4 (NFATc4)蛋白表达;Elisa方法检测心肌细胞H2S含量;激光共聚焦显微镜检测心肌细胞钙离子浓度;细胞免疫荧光检测NFATc4核转位变化.结果:①心肌细胞肥大时,CSE/H2S水平、miRNA-133amRNA表达均显著下降.应用NaHS预处理,能上调心肌细胞CSE/H2S水平,增加H2S含量和miRNA-133amRNA表达,并明显抑制心肌细胞肥大.②心肌细胞肥大时,细胞内钙离子浓度明显增加,CaN表达和NFATc4胞核蛋白表达增加,NFATc4核转位明显增强;应用NaHS预处理能明显抑制ISO诱导的上述效应.③应用antagomir-133a能逆转H2S抑制心肌细胞肥大的作用,使心肌细胞内钙离子浓度、CaN表达和NFATc4胞核蛋白表达增加,NFATc4核转位增强.结论:H2S通过负性调控作用抑制心肌细胞肥大,该作用可能与H2S上调miRNA-133a的表达,抑制其下游的Ca2+/CaN/NFATc4信号通路的激活有关.

目的:探讨间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)对炎症介导的肺动脉血管平滑肌细胞(PASMC)增殖的调控机制.方法:取4～6代处于对数生长期人脐带MSC,建立体外细胞培养体系,分为对照组(PASMC)、T淋巴细胞刺激组(PASMC +T淋巴细胞)、MSC-CM干预组(PMSMC + T淋巴细胞+ MSC-CM);分别于培养第3天时,检测3组培养上清中肿瘤坏死因子(TNF)-α含量、PASMC的增殖、钙调神经磷酸酶(CaN)活性及活化的T淋巴细胞核因子2(NFATc2)活化情况.结果:与T淋巴细胞刺激组比较,MSC-CM干预组TNF-α的生成显著减少(P<0.0l);与对照组和T淋巴细胞刺激组比较,MSC-CM干预组的PASMC内CaN的磷酸酶活性降低、NFATc2的活化减少,PASMC的增殖降低(P<0.01).结论:MSC-CM可能通过CaN/NFAT信号通路抑制炎症介导的PASMC增殖.

目的 探讨钙调磷酸酶/活化T细胞因子(CaN/NFAT)信号通路在有氧运动诱导原发性高血压大鼠(SHR)肠系膜动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钾通道(KV2.1)表达上调中的作用.方法 选用3月龄雄性WKY和SHR大鼠各24只,随机分为WKY安静组和运动组(WKY-SED组、WKY-EX纽)、SHR安静组和运动组(SHR-SED组、SHR-EX组).运动干预前和12周运动结束后分别测量大鼠安静状态下的心率和血压.分别采用免疫组化和Western blot检测KV2.1、CaN在肠系膜动脉的分布以及KV2.1、CaN、p-NFATc3、A型激酶锚定蛋白(AKAP150)和钙调蛋白(CaM)的蛋白表达.结果 (1)12周有氧运动后,与SHR-SED组相比,SHR-EX组心率、收缩压和平均动脉压均显著降低(P＜0.01);与WKY-SED组相比,WKY-EX组收缩压显著降低(P＜0.05).(2)与WKY-SED组相比,SHR-SED组KV2.1在肠系膜动脉的蛋白表达显著减少(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组KV2.1的蛋白表达显著增加(p＜0.01).(3)与WKY-SED组相比,SHR-SED组CaN在肠系膜动脉的蛋白表达显著增加(P＜0.01),p-NFATc3的蛋白表达显著减少(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组CaN的蛋白表达显著减少(P＜0.01),p-NFATc3的蛋白表达显著增加(P＜0.01).(4)与WKY-SED组相比,SHR-SED组的AKAP150蛋白表达显著增加(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组的AKAP150蛋白表达显著减少(P＜0.01).(5)与WKY-SED组相比,SHR-SED组的CaM蛋白表达显著增加(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组的CaM蛋白表达显著减少(P＜0.01);相比WKY-SED组,WKY-EX组CaM的蛋白表达量显著升高(P＜0.05).结论 钙调磷酸酶/活化T细胞核因子信号通路表达上调是高血压引起KV2.1通道功能下降的重要原因,有氧运动可以有效抑制这种作用,这可能是有氧运动缓解高血压及重塑血管功能的机制之一.

毛蕊花糖苷是地黄叶中的主要成分,这种物质因在糖尿病及其并发症中有显著的治疗作用而引起全世界更多的关注.它能通过增加酪氨酸磷酸酶1活性、抑制钙调磷酸酶/活化T细胞核因子等细胞通路来减轻糖尿病肾病(DN)的微炎症反应,通过下调转化生长因子 β,抑制上皮间充质转化,进而抑制DN的纤维化进展.另外,它还可以减少尿蛋白,保护肾功能,从而在临床上对DN提供新的治疗思路.因此对毛蕊花糖苷的药理作用、免疫机制等相关研究,将促进这一物质资源的开发和利用.

目的 α1肾上腺素能受体(α1-AR)介导的交感神经通路与心肌重构及纤维化病理过程中的心房钠尿肽(ANP)和脑钠肽(BNP)表达及其活性调节密切相关.文章观察α1-AR激动剂苯肾上腺素(PE)对ANP、BNP表达的影响,初步探讨作用机制及其与钙调神经磷酸酶-T细胞转录活化因子3(CaN-NFATc3)、丝裂原活化蛋白激酶MEK3-丝裂原活化蛋白激酶P38(MEK3-P38 MAPK)相关信号通路的关系.方法 体外分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞(CMs),细胞培养72 h后分为5组进行实验:对照组、PE组、Praz+PE组、CsA+PE组、SB203580+PE组.其中预处理组中CsA、Praz以及SB203580先单独孵育细胞1 h,后用PE(50μmol/L)继续作用5 h,共6 h;PE组仅用单药持续处理6 h.药物处理后,镜下观察心肌细胞状态,并运用锥虫蓝计数及MTT法测定各组CMs增殖,比色法测定干预后的各组心肌细胞活力;低温裂解细胞提取细胞蛋白,运用免疫印迹法定量测定前体钠尿肽(proANP)、前体脑钠肽(proBNP)、CaN及p-P38MAPK蛋白在各组细胞中的表达;以ELISA法测定各组细胞NFATc3、MEK3蛋白含量.结果 Praz+PE组细胞排列稀疏,细胞核固缩,光镜下未见细胞规律跳动,状态较差;CsA+PE组细胞异形化,边缘光亮,细胞呈纤维条索状;SB203580+PE组细胞细胞质淡染,细胞核少量碎片化,换液时可见较多漂浮死亡细胞.与对照组相比,除PE组的A值(0.78±0.09)上调外,Praz+PE组、CsA+PE组、SB203580+PE组(0.31±0.09、0.47±0.12、0.42±0.14)心肌细胞活力均有不同水平下降(P<0.05);Praz+PE组、CsA+PE组、SB203580+PE组较PE组减低(P<0.05);CsA+PE组、SB203580+PE组较Praz+PE组升高(P<0.05).与对照组比较,PE组心肌细胞ProANP、ProBNP的表达明显升高(P<0.01),而Praz+PE组、CsA+PE组和SB203580+PE组中表达均被不同程度抑制(P<0.05);与PE组相比,Praz+PE组、CsA+PE组和SB203580+PE组中表达均明显减低(P<0.05);CsA+PE组和SB203580+PE组均较Praz+PE组表达升高(P<0.05).与对照组相比,PE组中CaN、p-P38表达升高(P<0.05),而Praz+PE组、CsA+PE组及SB203580+PE组表达均有不同程度减低(P<0.05);Praz+PE组、CsA+PE组、SB203580+PE表达均较PE组明显减弱(P<0.05);CsA+PE组及SB203580+PE组中CaN的表达较Praz+PE组不同程度上调(P<0.05);CsA+PE组中p-P38的表达较Praz+PE组升高(P<0.05).相较于对照组,PE组表达NFATc3、MEK3有较明显增高(P<0.05),而Praz+PE组、CsA+PE组和SB203580+PE组表达均下调(P<0.05);Praz+PE组、CsA+PE组、SB203580+PE组较PE组均明显减弱(P<0.05);CsA+PE组、SB203580+PE组较Praz+PE组明显升高(P<0.05).结论 PE可诱导激活体外心肌细胞中有关ANP、BNP合成的信号通路;CaN-NFATc3及MEK3-P38相关的信号通路可能参与α1-AR介导的心肌细胞ANP、BNP的分泌.

目的 探讨钙调神经磷酸酶(CaN)-活化的T细胞核因子(NFAT)3通路是否介导乙醛脱氢酶(ALDH)2对高糖处理的乳鼠心室肌细胞的作用.方法 无菌条件下取出生3 d内SD大鼠乳鼠心脏,心尖部剪碎并用胰蛋白酶和胶原酶2混合酶消化成单个细胞,经差速贴壁后并在培养液中加入5-Brdu进行培养,当其生长呈融合状态时对心室肌细胞进行处理.应用免疫荧光检测培养的乳鼠心肌细胞内α-SA蛋白以此鉴定原代培养心室肌细胞纯度;实验涉及如下分组:5.5 mmol/L糖对照组(M)、30 mmol/L高糖组(MH)、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂(Alda-1)组(MHA)、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2抑制剂(Daidzin)组(MHD)、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂(Alda-1)和NFAT3抑制剂(11R-VIVIT)组(MHAV);荧光探针检测细胞内钙离子浓度;ELISA测定细胞内CaN含量;Western blot检测ALDH2、CaN、NFAT3蛋白表达.结果 与M组相比,MH组ALDH2蛋白表达降低(P<0.05),CaN蛋白表达增高(P<0.05)、NFAT3蛋白表达以及细胞内CaN含量、Ca2+浓度均增高(P<0.01);与MH组相比,MHA组Ca2+浓度降低(P<0.05)、细胞内CaN含量降低(P<0.01)、CaN蛋白和NFAT3蛋白表达降低(P<0.05)、ALDH2蛋白表达增加(P<0.05),MHD组Ca2+浓度升高(P<0.01)、细胞内CaN含量升高(P<0.05);与MHA组相比,MHAV组的ALDH2蛋白表达量无明显变化(P>0.05),NFAT3蛋白表达量降低(P<0.05).结论 线粒体ALDH2对高糖诱导的乳鼠心肌细胞起保护作用,其机制可能与ALDH2对Ca2+-CaN-NFAT3信号通路的负调节作用有关.