目的:应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法:选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型，设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003，应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞，48 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出效率最高者crRNA001，并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板；用crRNA001和ssODN共转染肝细胞，模板特异性引物行PCR，验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。 结果:Sanger测序结果显示，crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后，模板特异性引物行PCR，能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带；二代测序结果显示，ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论:CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率，相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因，为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

背景:阿尔茨海默病的免疫相关致病机制尚不明确,通过生物信息学探讨阿尔茨海默病患者NK细胞与铜死亡机制的相关性,可为研究阿尔茨海默病的发生发展提供新方向.目的:使用生物信息学分析方法筛选阿尔茨海默病患者外周血中NK细胞与铜死亡相关的关键基因,并在临床标本水平加以验证.方法:利用GEO在线数据库筛选阿尔茨海默病患者外周血转录组差异表达基因和NK细胞相关基因,与已报告的铜死亡因子取交集,获取差异表达的铜死亡相关基因;接着采用RT-qPCR技术对基因相对表达量进行实验验证,实验样本来自于安徽省立医院神经内科2021-2023年住院患者的外周血,按照纳排标准纳入疾病组30例及对照组20例.后续进一步使用在线GeneMANIA网站构建蛋白质-蛋白质互作网络;利用R语言进行免疫浸润分析;基于ENCODE数据库进行转录因子预测.结果与结论:①利用GSE63060数据集中阿尔茨海默病患者外周血转录组差异表达基因、GSE168522数据集中NK细胞相关基因、已报告的铜死亡基因,应用在线韦恩图工具、LASSO算法及随机森林机器学习方法筛选获取4个差异表达的铜死亡相关基因:铁氧还原蛋白1(ferredoxin 1,FDX1)、铜离子转运ATP酶a肽(ATPase Cu2+transporting alpha polypeptide,ATP7A)、丙酮酸脱氢酶β(pyruvate dehydrogenase El subunit beta,PDHB)和二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶(dihydrolipoamide succinyltransferase,DLST).②临床样本实验验证,FDX1和ATP7A在阿尔茨海默病患者外周血中表达上调(P<0.001),且在载脂蛋白E4不同基因型中呈差异性表达(P<0.01,P<0.001);PDHB和DLST在阿尔茨海默病患者外周血中表达下调(P<0.001),在载脂蛋白E4不同基因型中表达无显著性意义(P>0.05).③蛋白质-蛋白质互作网络发现20种功能蛋白与关键基因相关联,免疫浸润分析结果验证了关键基因与12个免疫细胞具有显著相关性(以P<0.05为具有相关性).④生物信息学分析与实验验证结果提示,FDX1,ATP7A,PDHB和DLST基因在阿尔茨海默病中存在差异性表达,这4个基因在阿尔茨海默病外周血的NK细胞中可能通过铜死亡机制参与了疾病的发生发展,文章结果为阿尔茨海默病的诊断及治疗提供了潜在的靶点.

目的 了解儿童肝豆状核变性的起病临床特点,明确基因诊断在儿童肝豆状核变性患者中的意义.方法 选取2011年至2018年就诊于北京协和医院儿科门诊的75例肝豆状核变性患儿进行回顾性研究;进行铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因测序、多重连接探针扩增技术(MLPA)分析;对其起病时临床表现及基因检测结果进行总结.结果 75例儿童肝豆状核变性患者中,男女比例为1.27∶1,年龄为(6.5±4.0)岁(1.3～17.5 岁).55 例以无症状肝酶升高起病,所有患者铜蓝蛋白均＜0.2 g/L,72例患者24小时尿铜＞40 μg,其中29例患者24小时尿铜在40～100 μg之间,16例患儿K-F环阳性,可以临床确诊的共有16例(21%),有15例年龄均＞7岁.75例进行了ATP7B基因检测,共检出48种致病变异.最常见的致病变异为c.2333G＞T、p.R778L、c.2621C＞L、p.A874V、c.2975C＞T、p.P992L,其等位基因频率分别为30.49%、14.89%、9.92%.结论 对于儿童患者,多表现为无症状肝酶升高,K-F环阳性率较低,临床确诊难度大.本研究临床确诊率为21.33%,基因检测对于该病的早期诊断和治疗具有重要意义.

目的 研究长链非编码RNA-生长阻滞特异转录物5(GAS5)对肾脏纤维化的作用及机制.方法 收集临床肾穿刺患者的组织标本,用原位免疫荧光方法检测GAS5在组织上的定位和表达情况;构建小鼠单侧输尿管梗阻肾脏纤维化模型,用原位免疫荧光方法检测GAS5在肾组织上的定位以及表达情况;用转化生长因子-β(TGF-β)刺激肾小管上皮细胞后,用Real-time PCR方法检测GAS5的表达水平;在肾小管上皮细胞中转染GAS5过表达质粒后,用Western印迹法检测细胞外基质蛋白胶原蛋白3(Co13)、纤连蛋白1(FN1)、铜转运蛋白1(CTR1)和铜离子转运ATP酶α肽(ATP7a)的表达水平,用Real-time PCR方法检测miR-21、miR-29、CTR1和ATP7a的表达.在肾小管上皮细胞中过表达miR-29后,用Western印迹法检测CTR1的表达;在肾小管上皮细胞中过表达miR-21后,用Western印迹法检测ATP7a的表达.结果 在不同肾脏纤维化模型中,GAS5均较对照组表达下调.在肾小管上皮细胞中,过表达GAS5抑制Co13和FN1的合成(P＜0.05);过表达GAS5可上调miR-29的表达,并下调miR-21的表达(P＜0.05).miR-29在转录后水平抑制CTR1的蛋白表达(P＜0.05),且过表达GAS5能够降低CTR1的蛋白表达(P＜0.05);miR-21在转录后水平抑制ATP7a的蛋白表达(P＜0.05),但过表达GAS5不影响ATP7a的表达.结论 长链非编码RNA-GAS5通过上调miR-29,在转录后水平抑制铜转运蛋白CTR1,进而抑制肾脏纤维化.

肝豆状核变性,是位于 13 号染色体上的ATP7B基因突变导致的一种常染色体隐性遗传病.ATP7B基因突变可能会导致其编码的ATP7B蛋白(铜离子转运ATP酶β肽)结构改变及功能受损,使肝细胞的铜转运及代谢发生障碍,引起铜的异常沉积,进而出现病理表现.本文对ATP7B基因及其编码蛋白的结构功能、ATP7B基因突变的类型及其分布、突变对ATP7B蛋白结构和功能的影响进行了归纳梳理,为进一步分析WD致病的分子机制提供参考.

肝豆状核变性,即WilSon病,是一种由铜离子转运ATP酶β肽(ATPase Cu2+ transporting beta polypeptide,ATP7B)基因突变导致的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病.现归纳总结不同突变的致病机制,包括诱导突变蛋白错误定位、改变蛋白间或结构域间相互作用、调控ATP7B蛋白催化活性、改变ATP7B基因剪接方式等多个方面.临床上,系统总结了常见突变与临床表型间的关联,如p.R778L,被认为与更加严重的临床症状相关;同时,环境、饮食、生活习惯等因素的差异亦可能对患者是否发病或发病时间产生较大影响.在分子层面上对ATP7B基因突变致病机制及所致临床表征的研究进行综述,将有助于加深对肝豆状核变性发病机制的认识,并提示可针对不同的机制采用个性化的诊疗手段,以指导临床实践.