目的 探讨茵陈水提物对多药耐药蛋白 3(MDR3)基因突变导致的新生儿肠外营养相关性胆汁淤积(PNAC)的保护作用及可能机制.方法 ①将人原代培养肝细胞应用体外细胞培养、CRISPR/Cas9 慢病毒感染、MDR3 突变基因导入等技术处理后,比较 1%脂肪乳诱导处理前(0)和处理后 16、32、48 h不同时间点肝细胞上清液中肝胆生化指标[丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、间接胆红素(IBil)、总胆汁酸(TBA)]的水平,确定构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间.②将人原代培养肝细胞株按随机数字表法分为空白对照组、MDR3 基因野生型组、MDR3 基因突变组、茵陈水提物干预组.空白对照组只用培养液处理,MDR3 基因野生型组应用慢病毒感染融入野生型MDR3基因和培养液培养,MDR3 基因突变组应用慢病毒感染慢病毒导入MDR3(c.485T＞A、c.2793insA、c.1031G＞A、c.3347G＞A)突变基因和培养液培养,茵陈水提物干预组应用慢病毒感染导入MDR3 突变基因和培养液培养的基础上,加入 100 g/L茵陈水提物预处理,然后将 4 组肝细胞分别加入 1%脂肪乳诱导处理,处理时间为构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需时间.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定 4 组肝细胞上清液中肝胆生化(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测4组肝细胞编码MDR3、胆盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白(MRP)2～4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的三磷酸腺苷结合盒蛋白(ABCB4、ABCB11、ABCC2、ABCC3、ABCC4)和TNF基因mRNA的表达丰度.结果 与空白对照组和MDR3基因野生型组比较,MDR3基因突变组在经1%脂肪乳诱导处理前和处理后16h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平比较差异无统计学意义,经 1%脂肪乳诱导处理 32h和 48 h MDR3 基因突变组肝细胞上清液肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平均明显升高(均P＜0.05),确定构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间为 32 h.与MDR3 基因突变组比较,茵陈水提物干预组肝细胞在脂肪乳处理后 32h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、TBA)水平均明显降低[ALT(ng/L):148.3±2.3 比 164.9±7.0,AST(ng/L):2767.4±78.8 比 3239.4±107.1,TBil(μmol/L):7.6±0.2比13.6±0.3,DBil(μmol/L):1.8±0.1比5.7±0.2,TBA(μmol/L):3.4±0.2比6.7±0.1,均P＜0.05];空白对照组、MDR3 基因野生型组、MDR3 基因突变组和茵陈水提物干预组肝细胞编码MDR3、MRP2、MRP3、MRP4 的ABCB4、ABCC2、ABCC3、ABCC4 基因mRNA表达丰度差异无统计学意义;TNF基因mRNA在MDR3基因突变组呈高表达(2-??Ct:1.258±0.200比1.001±0.052),茵陈水提物干预组呈低表达(2-??Ct:0.387±0.247 比 1.258±0.200),组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).与MDR3 基因突变组比较,茵陈水提取物干预组肝细胞编码BSEP的ABCB11 基因mRNA的表达丰度明显增高(2-??Ct:2.955±0.479 比 1.333±0.529,P＜0.05).结论 茵陈水提物对MDR3 基因突变导致的PNAC有一定保护作用,可能与拮抗炎症反应,降低TNF基因的mRNA表达和改善编码BSEP的ABCB11 基因的mRNA表达有关.

我国非新生儿破伤风防控形势严峻，强化含破伤风类毒素疫苗（TTCV）的主动免疫是非新生儿破伤风防控的关键。通过破伤风抗体（TAB）检测可以明确个体的TTCV免疫状态，从而正确实施TTCV主动免疫。国外对TAB检测技术的研究呈现停滞状态，而国内有现实的TAB检测需求，破伤风抗体检测技术仍然处于动态发展过程中。本文收集国内也相对有限的TAB检测技术资料，对国内应用和发展的小鼠毒素中和试验（MTNT）、间接血凝法（IHA）、凝胶双向扩散试验或Rubin法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金（CG）法等TAB检测技术进行总结，以期为国内TAB检测提供较全面的依据。由于缺乏国内TAB检测和国际机构、参考试剂的对比研究，我国的TAB检测技术尚未实现国际化认可。我国特殊的破伤风防控形势使得TAB检测技术研究在国内有一定的现实意义，ELISA、CG法等快速检测试剂具备一定的应用价值。

目的:掌握克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）片段的精细抗原表位谱分布，明确优势抗原表位在克里米亚-刚果出血热（CCHF）实验室检测中的价值。方法:2014—2021年在新疆大学生命科学院实验室将CCHFV YL04057株采用改良生物肽合成方法分段表达出由8个氨基酸组成的最小合成短肽，以CCHFV多克隆抗体或单克隆抗体14B7（IgM）或CCHFV阳性羊血清为抗体，用免疫印迹方法鉴定出NP和GP片段上具有抗原活性的最小抗原表位（BCE），并采用邻接法将获得的具有序列多态性的BCE与不同地区的CCHFV进行空间聚类，确定BCE组合方式与地理区域分布的相关性，探讨其在建立血清学诊断中的应用价值。采用原核表达质粒（pET-32a、pGEX-KG）和带有不完整谷胱甘肽（GST188）标签的原核表达质粒（pXXGST-ST-1）构建和表达NP片段上6个不同肽段长度的优势抗原表位，建立间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测方法，以经免疫荧光法（IFA）鉴定的CCHF羊血清为对照，统计分析不同肽段长度的抗原表位重组蛋白与IFA检测结果的特异度、敏感度和总符合率。结果:CCHFV NP和GP片段共有30个具有抗原活性的BCE，其中NP片段抗原表位集中的核心中间片段NP 2（aa 170~305）有6个BCE，两端的NP 1（aa 1~200）和NP 3（aa 286~482）有9个BCE；GP片段的Gc（aa 1~558）和Gn（aa 533~708）片段有14个BCE和1个包含15个氨基酸的长抗原肽（AP），NP片段BCE氨基酸序列的同源性为97.1%，GP片段对应的同源性为89.1%。在GP片段9个具有序列多态性的BCE中，由GnEc1、GnE2、GnE4、GcE3、GcE6和GcAP-4（Ap）6个组合BCE可将15株来自全球不同地区的CCHFV聚类成亚洲Ⅰ、亚洲Ⅱ、非洲Ⅰ、非洲Ⅱ和欧洲 5个地理类群。构建表达的PET-32a-NP（全长）、PGEX-KG-NP 2（aa 170~305）、pGEX-KG-NP 2-1（aa 235~275）、PGEX-KG-NP 2-1-1（aa 237~256）、pXXGST-1-NP 2-1-2（aa 250~265）和PGEX-KG-NP 2-1-3（aa 260~276）6个重组蛋白CCHFV NP兔多克隆抗血清（pAb）免疫印迹反应阳性，以33份经IFA CCHF检测的羊血清为参照，以NP 2和NP 2-1 2个片段构建的重组蛋白为抗原建立的间接ELISA检测方法检测敏感度、特异度和总符合率最好，敏感度分别为73.4%（11/15）和66.7%（10/15），特异度分别为100%（18/18）和94.4%（17/18），总符合率分别为87.9%（29/33）和81.8%（27/33）。 结论:CCHFV NP和GP上分布着数量较多的具有抗原免疫活性的BCE，其中，优势抗原表位在CCHF实验室血清学诊断中具有较高的应用价值。

目的:观察慢性心力衰竭患者白细胞介素-35（IL-35）水平和CD14 +单核细胞功能变化。 方法:连续入组2018年7月至2019年6月在郑州大学第一附属医院心血管内科住院治疗的慢性心力衰竭患者（74例）和健康对照者（29名），清晨空腹采集抗凝外周血20 ml并分离血浆，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血IL-35水平；纯化外周血CD14 +单核细胞，采用实时定量聚合酶链反应法检测CD14 +单核细胞中IL-35受体亚基IL-12Rβ2和gp130 mRNA相对表达量。以IL-35刺激CD14 +单核细胞，与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）直接或间接接触培养，采用ELISA法检测上清中细胞因子和颗粒酶B水平，通过检测乳酸脱氢酶水平计算HUVEC死亡比例。比较慢性心力衰竭组和健康对照组间上述指标的差异。 结果:慢性心力衰竭组的年龄为（59.4±12.1）岁，男性占58.1%（43例）；健康对照组的年龄为（53.9±9.8）岁，男性占65.5%（19名）；慢性心力衰竭组血浆IL-35水平高于健康对照组［（22.89±7.58）mg/L比（16.42±5.47）mg/L， P<0.001］，gp130 mRNA相对表达量亦然（1.07±0.19比0.98±0.15， P=0.022）。慢性心力衰竭组CD14 +单核细胞诱导HUEVC死亡比例在直接和间接接触培养中均低于健康对照组（均 P<0.001），分泌颗粒酶B水平低于健康对照组（ P<0.001）。抑制颗粒酶B后CD14 +单核细胞诱导HUVEC死亡比例降低（ P=0.011）。IL-35刺激CD14 +单核细胞后，其诱导HUVEC死亡比例和颗粒酶B分泌水平降低（均 P<0.001）。 结论:慢性心力衰竭患者血IL-35表达升高，IL-35可通过抑制颗粒酶B分泌诱导CD14 +单核细胞功能不全，进而促进心力衰竭疾病进程。

目的:探讨新疆出血热病毒（XHFV）糖蛋白的2个抗原优势区（GcⅠ和GcⅡ）以不同嵌合策略以及不同免疫方式诱导小鼠免疫应答的效果。方法:以在5'端加入或不加鼠白细胞介素-2（IL-2）信号肽与通用型辅助性T细胞（Th）表位为不同设计策略，将GcⅠ、GcⅡ及GcⅠ上已鉴定出来的表位（Gc 233~248、Gc 241~256和Gc 281~296）分别进行融合并构建至真核表达载体pVAX1与原核表达载体pET-28a上。采用间接免疫荧光法检测重组真核质粒的体外表达效果后进行大量提取，将重组原核质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达及纯化。通过基因免疫、蛋白免疫和DNA初免-蛋白加强免疫（联合免疫）3种方式免疫BALB/c小鼠，酶联免疫吸附测定法检测小鼠体内IgG抗体水平以及小鼠脾细胞培养上清中IL-4和干扰素-γ（IFN-γ）的含量，噻唑蓝比色法检测小鼠脾T淋巴细胞的增殖情况。 结果:双酶切及测序结果表明8种重组质粒构建成功。荧光显微镜下可见构建的重组真核质粒在体外细胞均能成功表达。3次免疫小鼠后，各实验组的小鼠血清IgG抗体水平和刺激指数均明显高于对照组（均 P<0.01）。Th2型细胞因子IL-4与Th1型细胞因子IFN-γ的质量浓度检测结果表明，联合免疫组引起的免疫应答偏向Th1型。 结论:成功构建了XHFV糖蛋白的多表位嵌合疫苗且靶抗原在小鼠体内可有效表达，各免疫组与对照组相比均激发了较强的体液免疫及细胞免疫应答，其中pVAX1-ST（GcⅠe+GcⅡ）联合重组蛋白r（GcⅠe+GcⅡ）的免疫效果最好，有望作为XHFV的新型候选疫苗。

目的:探究右美托咪定（dexmedetomidine, Dex）预防经尿道前列腺切除术（transurethral resection of prostate, TURP）患者术后谵妄（postoperative delirium, POD）及术后躁动（postoperative agitation, PA）的效果，并分析其对生殖激素的影响。方法:行TURP的患者168，按随机数字表法分为对照组和观察组（每组84例）。对照组术后给予常规舒芬太尼、丙泊酚患者自控静脉镇痛治疗，观察组在对照组基础上联合应用Dex进行患者自控静脉镇痛治疗。记录患者术后2、8、12、24 h VAS评分与Ramsay镇静评分，记录患者术后1、2、3 d POD的发生率，ELISA法检测患者术后24 h及术后1周血清生殖激素水平，记录患者术后2、8、12、24 h MAP与心率，观察术后1周内患者不良反应发生情况。结果:与对照组比较，观察组术后2 h Ramsay镇静评分，术后8、12、24 h VAS评分和Ramsay镇静评分降低（ P<0.05）。观察组患者手术当日，术后1、2 d POD发生率及术后3 d内POD总发生率低于对照组（ P<0.05）。术后24 h，观察组患者血清睾酮（testosterone, T）和雌激素（estrogenic hormone, E2）水平高于对照组（ P<0.05），而卵泡刺激素（follicle stimulating hormone, FSH）和黄体生成素（luteotropic hormone, LH）的水平与对照组比较，差异无统计学意义（ P>0.05）。术后1周，两组患者血清生殖激素水平较术后24 h均升高（ P<0.05）。两组患者术后各时点MAP和心率差异无统计学意义（ P>0.05）。对照组患者术后仅出现1例恶心呕吐，观察组无不良反应发生。 结论:TURP患者术后采用Dex镇痛效果显著，可有效降低POD与PA的发生率，从而间接促进性腺功能尽快恢复，帮助患者早日康复。

目的:获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原，并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法:人工合成密码子优化的 GTV-NP 编码基因，克隆至 pET32a（+）载体，构建重组表达质粒，转化至 BL21（DE3）。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原，建立并优化GTV IgG抗体间接ELISA检测方法，并对其进行评价和初步应用。结果:成功构建原核表达质粒pET32a-NP，重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达，大小约为44 kD，Western blot结果表明重组蛋白与GTV阳性血清具有良好的抗原性。建立的ELISA法特异性强、敏感性高、批内和批间的变异系数均小于10%具有较好的重复性；检测结果与IFA检测结果符合率达到92.77%。结论:建立的GTV NP 抗体检测ELISA方法的敏感性、重复性和特异性均较好。

目的:初步了解重组人tau441 (P301S)蛋白体外聚集、抗原性及免疫原性等生物学性质。方法:原核表达带His标签的tau441 (P301S)重组质粒，镍亲和层析纯化重组蛋白，BCA测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色确定蛋白的纯度；采用Western blot (WB)和负染透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)鉴定；间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测所得蛋白的抗原性；以重组蛋白免疫小鼠，检测免疫血清特异性抗体滴度来分析其免疫原性。结果:所得重组人tau441 (P301S)纯度为70%，WB显示在相对分子质量(Mr.×10 3)64和更高相对分子质量处有特异性条带。TEM显示，tau441 (P301S)呈絮状团块聚集，团状面积显著大于tau441野生型蛋白(t＝6.439, P＝0.003)；4 ℃孵育9 d后，tau441 (P301S)形成明显的纤维状结构。间接ELISA结果显示，tau441 (P301S)能被tau单抗HT7(1∶80 000)识别；小鼠免疫血清tau特异性抗体滴度达到1∶128 000，且WB显示，免疫后血清识别阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)转基因小鼠脑裂解抽提物。 结论:重组人tau441 (P301S)蛋白具有体外聚集性增强的特性但其抗原性和免疫原性未改变。

目的:探讨缺氧条件下，中介素(IMD)和肾小球系膜细胞(HMC)对内皮细胞的影响。方法:内皮细胞分为4组：(1)内皮细胞与系膜细胞共培养，加IMD处理作为HEMI组；(2)内皮细胞与系膜细胞共培养，无处理作为HEM组；(3)内皮细胞加IMD处理作为HEI组；(4)内皮细胞无处理作为HE组；将各组细胞在1%O 2、94%N 2、5%CO 2条件下缺氧培养12 h后，蛋白质印迹法(Western blot)、免疫细胞化学技术检测相关蛋白表达，实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测相关基因mRNA相对表达量，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血管内皮生长因子A(VEGFA)含量，体外血管形成实验检测内皮细胞的成管分支数。实验结果两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:上皮型钙黏分子(VE-cadherin)表达量HEMI(1.629±0.197、1.557±0.066、10.552±0.523)高于HEM(1.116±0.118、1.340±0.161、8.128±0.542)、HEI(1.278±0.096、1.078±0.088、7.523±1.211)、HE组(1.000±0.000， F＝0.734、1.244、6.134， P<0.05)，差异有统计学意义；血小板内皮细胞黏附分子(PECAM-1/CD31)表达量HEMI(1.309±0.234、1.203±0.105、1.654±0.462)高于HEM(1.067±0.379、1.038±0.035、1.601±0.397)、HEI(1.225±0.091、1.101±0.038、1.605±0.207)、HE组(1.000±0.000)，差异无统计学意义( F＝5.083、5.434、6.428， P>0.05)；VEGF表达量HEMI(0.904±0.005、1.922±0.457)高于HEM组(0.690±0.071、1.000±0.000， F＝8.307、10.896， P<0.01)，ELISA中加入IMD组(1.018±0.319)VEGFA浓度比值高于对照组(0.921±0.294， F＝0.132， P<0.05)，差异有统计学意义；体外血管形成中HEMI(22.289±0.131)、HEM(21.318±0.594)、HEI(21.533±0.867)、HE(20.755±1.798)高于NE组(18.731±0.525， F＝5.926、0.030、1.033， P<0.05； F＝6.753， P>0.05)。 结论:缺氧条件下，IMD可以直接或通过系膜细胞间接双重影响内皮细胞，促进血管形成。

目的:采用肺炎克雷伯菌耐药靶标KPC-2为抗原制备重组蛋白疫苗，在小鼠肺炎模型中评价疫苗的免疫原性、保护效果和保护机制。方法:利用大肠埃希菌原核表达系统表达肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白，经GST亲和层析对目的蛋白进行纯化；采用KPC-2蛋白制备疫苗，经皮下注射免疫新西兰兔，心脏采血分离血清，用Protein G亲和层析纯化多克隆抗体，同时运用调理吞噬杀菌试验检测抗体的体外杀菌活性。采用KPC-2疫苗免疫雌性BALB/c小鼠3次，间接ELISA检测血清中特异性IgG抗体滴度。末次免疫后7 d，通过气管插管构建小鼠肺炎克雷伯菌肺部感染模型，感染1 h后尾静脉给予0.1 mg美罗培南治疗，通过比较免疫组与佐剂组的生存率、细菌定植量和组织病理学差异，以及给药组与生理盐水组生存率的差异评价疫苗的保护效果。采用KPC-2多克隆抗体被动免疫评价抗体的保护效果。结果:KPC-2免疫组小鼠血清特异性IgG水平显著高于对照组( t＝4.325, P<0.05)，免疫组生存率显著高于对照组[70% (7/10) vs 10% (1/10)， P<0.05]；免疫组小鼠肺组织炎性程度及细菌定植量显著低于对照组( t＝3.127, P<0.05)；疫苗主动免疫与被动免疫均具有良好的保护效果，且对抗生素治疗有明显的增效性；KPC-2多克隆抗体在体外表现出明显的吞噬杀菌活性( t＝5.427, P<0.05)。 结论:KPC-2疫苗具有良好的免疫原性和保护效果，体液免疫应答在其保护中发挥了重要作用，证明采用耐药靶标作为抗原制备疫苗具有可行性。