目的:以人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）为模型，结合实时细胞分析（RTCA）技术建立并验证体外药物心脏毒性评估系统。方法:选用不同浓度的胺碘酮、维拉帕米及多柔比星（阿霉素），分别与商业化来源的hiPSC-CMs孵育，利用RTCA系统实时观察药物作用时及洗脱后不同时间段hiPSC-CMs自主搏动（搏动频率和幅度）、细胞指数及校正的场电位时限（FPDc）变化。结果:1 μmol/L胺碘酮作用12 h后，hiPSC-CMs大部分搏动振幅被抑制；10 μmol/L浓度胺碘酮作用48 h使细胞指数下降12.22%（ P<0.05），自主搏动抑制（ P<0.001），药物洗脱后未见自主搏动恢复。与对照组相比，100 nmol/L维拉帕米作用12 h使搏动振幅下降47.38%（1.05±0.08对0.55±0.13， P<0.001），FPDc缩短33.33%（ P<0.05），在药物洗脱后该组搏动振幅、FPDc恢复；而10 μmol/L维拉帕米作用12 h后搏动振幅完全被抑制，细胞指数下降9.60%（ P<0.01），药物洗脱后未见恢复。多柔比星10 nmol/L、100 nmol/L组对各细胞参数无影响，而10 μmol/L组作用12 h后细胞指数下降35.87%（ P<0.001），自主搏动、FPDc受到抑制（ P<0.001），洗脱后自主搏动未恢复。 结论:以hiPSC-CMs为模型，结合RTCA技术可在体外有效评估不同药物的药理学及毒性，为后续药物早期心脏药理学研究提供方法学参考和理论依据。

目的 探讨维拉帕米提高食管癌化疗药物敏感性及促进细胞凋亡的影响.方法 采用CCK-8法检测紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶对于4种食管癌细胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)的IC50值(IC501);用维拉帕米(4.91 μg/mL)联合上述化疗药物处理每种细胞,CCK8法检测维拉帕米联合上述化疗药物针对上述4种食管癌细胞株(EC109,EC9706,KYSE-450和TE-1)IC50值(IC502);以前期实验得出的VER逆转化疗耐药能力差异最为显著的一对食管癌细胞为研究对象,Annexin V-PI双染法检测食管癌细胞凋亡.结果 紫杉醇在KYSE-450和EC9706的IC50值明显大于EC109和TE-1,顺铂在TE-1细胞中IC50值明显小于其他3种细胞,5-氟尿嘧啶在EC109中IC50值明显高于在其他3种细胞.加用维拉帕米后,4种食管癌细胞系(EC109,EC9706,KYSE-450和TE-1)针对紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶的IC50值均不同程度下降,提示维拉帕米均不同程度提高了上述3种化疗药物的敏感性.其中,顺铂组未加入维拉帕米前,EC109,EC9706,KYSE-450与TE-1相比,均存在不同程度耐药性,加入维拉帕米后,针对EC9706 IC50值变化倍数较大(15.2倍),提示逆转敏感;针对EC109IC50值变化倍数较小(1.6倍),提示逆转耐受.结论 维拉帕米逆转EC9706的阿霉素效率指数最高(15.2倍),与EC109细胞相比有显著性差异(1.6倍).提示EC9706 (DDP)对维拉帕米的逆转敏感,而EC109 (DDP)对维拉帕米的逆转耐受.维拉帕米有可能通过促进细胞调亡途径提高其逆转化疗耐受的能力,从而增强化疗药物敏感性.

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平.方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S.viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究.结果 S.viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为:以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min.以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3％,其中,阿维拉霉素A占组分含量81％,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4％,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定.另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4％.结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力.

[目的]探讨Bcl-2在维拉帕米逆转胃癌阿霉素化疗耐药中的作用及初步机制研究.[方法]MTT法检测维拉帕米逆转胃癌细胞系(SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27)对3种化疗药物(氟尿嘧啶、阿霉素、顺铂)的耐药能力;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测维拉帕米对阿霉素作用下的胃癌细胞系(SGC-7901、HGC-27)凋亡水平的影响.Western blotting检测Bcl-2蛋白表达水平.[结果]SGC-7901细胞系在单药阿霉素组和阿霉素联合维拉帕米组中的半数抑制浓度(IC50)分别为1.51±0.12μg/ml、0.22±0.01μg/ml,两组差异有统计学意义(P＜0.05);HGC-27细胞中分别为1.24±0.19μg/ml、1.06±0.08μg/ml,两组差异无统计学意义(P＞0.05).凋亡实验表明在SGC-7901细胞系中,单药阿霉素组中的细胞凋亡率为36.76％,阿霉素联合维拉帕米组为61.10％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).HGC-27细胞系中,阿霉素组细胞凋亡率19.79％,阿霉素联合维拉帕米组为21.92％,两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).SGC-7901细胞中维拉帕米促进ADM组胃癌细胞凋亡指数明显高于HGC-27(P＜0.05). qRT-PCR实验显示Bcl-2可能介导维拉帕米促进胃癌细胞凋亡;Western blotting结果显示在SGC-7901细胞中,阿霉素联合维拉帕米组Bcl-2的表达明显低于单药阿霉素组,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);而HGC-27中2组间差异无统计学意义.[结论]维拉帕米通过下调Bcl-2表达增强维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐受的能力,并促进胃癌细胞凋亡.

目的 主要研究了硅胶吸附阿维拉霉素的动力学和热力学特性.方法 通过测定不同温度下阿维拉霉素在硅胶上的吸附量,绘制吸附动力学曲线和吸附等温线,并对硅胶吸附阿维拉霉素的动力学和热力学参数进行研究.结果 准二级动力学模型能更好的描述硅胶吸附阿维拉霉素的动力学行为,此吸附过程具有非均相未反应核收缩模型的特征,其中内扩散为主要速率控制步骤;Langmuir方程更好的拟合硅胶吸附阿维拉霉素的吸附等温线,吸附热力学参数吉布斯自由能变 (ΔG) 在309、303、297 K温度下的值分别为-8.752 9、-8.104 3和-7.455 6 k J·mol-1,焓变 (ΔH) 值为24.654 6 k J·mol-1,熵变 (ΔS) 值为108.115 2 J·mol-1·K-1.结论 该研究结果为进一步探讨硅胶柱分离纯化阿维拉霉素提供了理论基础.

目的:研究舒尼替尼(sunitinib)耐药内皮细胞HMEC-su细胞的耐药特性,并对其与内皮间质转化(EndMT)之间的关系进行初步探讨.方法:结晶紫染色法观察HMEC-su细胞的形态学变化;MTT法检测HMEC-su细胞对阿霉素(DOX)的敏感性,并计算耐药指数(resistance index,RI);罗丹明123 (rhodamine 123,Rho 123)外排实验评价HMEC-su细胞的耐药性;流式细胞仪检测细胞周期分布;划痕修复实验评价细胞的迁移能力;Western blot实验检测HMEC-1和HMEC-su细胞中EndMT相关蛋白血管内皮细胞钙黏素(VE-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达差异.结果:与HMEC-1细胞相比,HMEC-su细胞的形态发生明显变化,增殖速度减慢;HMEC-su细胞对DOX产生交叉耐药,RI为2.15(P＜0.01);Rho123蓄积实验显示,与HMEC-1细胞相比,HMEC-su细胞内Rho123荧光强度明显降低(P＜0.(01),给予维拉帕米(verapamil,VRP)处理1h后,HMEC-su细胞中Rho123荧光强度明显升高(P＜0.01);与HMEC-1细胞相比,HMEC-su细胞G0/G1期的细胞比例显著降低(P＜0.01),然而S期和G2/M期显著增加(P＜0.01,P＜0.05);划痕修复实验表明HMEC-su细胞的迁移能力明显高于HMEC-1细胞(P＜0.01);Western blot实验表面,与HMEC-1细胞比较,HMEC-su细胞中VE-cadherin表达显著降低(P＜0.01),α-SMA蛋白表达显著增加(P＜0.05).结论:HMEC-su细胞对DOX产生了交叉耐药,其细胞形态和周期分布存在着明显变化,初步确定EndMT与HMEC-su细胞耐药性的产生有关.

目的:利用人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)联合实时细胞分析(RTCA)技术,建立hiPSC-CMs体外心脏毒性评价模型,并选用阳性化合物进行验证.方法:研究选用商业化来源的hiPSC-CMs,选用不同作用机制的心脏毒性药物:蒽环类抗癌药阿霉素(0.3、1、3μmol·L-1)、K+通道阻滞剂多非利特(0.03、0.1、0.3 μmol·L-1)和E-4031(0.1、0.3、1μmol·L-1)、Na+通道阻滞剂美西律(3、10、30μmol·L-1)、多离子通道阻滞剂维拉帕米(0.1、0.3、1μmol·L-1)和苄普地尔(0.3、1、3μmol·L-1)、抗组胺药物特非那定(0.3、1、3μmol·L-1)和西沙必利(3、10、30 μmol· L-1),分别给予hiPSC-CMs作用48 h,采用RTCA技术连续监测心肌细胞搏动的频率、振幅、细胞指数、搏动图谱等指标在给药前后的变化.结果:阿霉素对心肌细胞的抑制作用呈现时效和量效依赖性特点;多非利特显著降低心肌细胞搏动幅度及频率;E-4031为1μmol·L-1时显著降低心肌细胞搏动频率,缩短振幅,而0.1、0.3μmol·L-1时则对心肌细胞无影响;30 μmol·L-1美西律作用2h内心肌细胞搏动频率相对空白对照组降低了66.4％,振幅缩短了60.7％,并导致心肌细胞搏动周期延长;苄普地尔浓度低于1μmol· L-1时对心肌细胞无影响,3 μmol·L-1苄普地尔作用2h导致心肌细胞搏动间歇性停搏,并伴随细胞活力轻微下降;维拉帕米作用2h内各剂量组心肌细胞搏动频率分别增强了12.2％、13.1％、52.3％,而振幅分别降低了20.0％、61.7％、67.6％.0.3 μmol·L-1以上浓度的维拉帕米导致心肌细胞搏动骤停(3/9);特非那定浓度≥1 μmol·L-1时短时间内即导致心肌细胞间歇性搏动骤停;西沙必利短期作用2h内显著降低心肌细胞搏动频率和幅度,10 μmol·L-1以上浓度的西沙必利持续抑制心肌细胞搏动频率.结论:hiPSC-CMs结合RTCA技术可用于预测药物的心脏毒性风险.

目的 观察维拉帕米逆转人食管癌细胞株对顺铂耐药程度,探讨维拉帕米逆转耐药与多药耐药蛋白P-gp的关系.方法 CCK-8法测5-氟尿嘧啶、阿霉素、顺铂对2种食管癌细胞株(KYSE-150、KYSE-510)的IC50值(IC501);联合维拉帕米的IC50值(IC502),以IC501/IC502结果判定维拉帕米逆转耐药能力.实时荧光定量PCR测各组多药耐药基因hMDR-1表达.Western-blotting测各组P-gp表达.结果 阿霉素、顺铂在KYSE-150的IC50值为7.33±0.67、3.23±0.06均小于KYSE-510的IC50值11.57±0.98、17.25±0.08,5-氟尿嘧啶在KYSE-150的IC50值24.33±1.67大于KYSE-510的IC50值14.67±1.02.联用维拉帕米后,各组IC50值均下降,提示维拉帕米提高药物敏感性.其中,顺铂组加入维拉帕米后,KYSE-510的IC50值变化较大(4.7倍)提示逆转敏感,KYSE-150的IC50值变化较小(1.84倍)提示逆转耐受.应用维拉帕米前后,各组hMDR1/P-gp表达没有明显变化.结论 KYSE-510对维拉帕米联合顺铂逆转敏感,而KYSE-150逆转耐受.维拉帕米逆转人食管癌细胞株耐顺铂不是通过改变hMDR1/P-gp的数量,而可能通过阻碍hMDR1/P-gp作用或其他未知机制来实现.

阿维拉霉素是由绿色产色链霉菌生产的寡糖类抗生素,对革兰氏阳性致病菌具有极强抗性,是一种新型饲料添加剂,广泛应用于肉鸡、仔猪等畜禽养殖中.以阿维拉霉素最新国内外研究进展为基础,综述了阿维拉霉素的抑菌机制、结构改造、菌种选育及发酵优化等方面的研究进展,重点阐述了阿维拉霉素的生物合成基因簇、合成途径及生物合成转录调控机制,探讨了提高阿维拉霉素产量的基因工程改造策略,为阿维拉霉素高效合成及工业化高产工程菌株构建等相关研究提供一定的理论参考.