纤维素是由 β-1,4 糖苷键链接而成的葡萄糖单体聚合物,广泛分布于自然界,是一类易获取且廉价的可再生资源.自然界含纤维素材料的利用和处理是目前亟待解决的问题,筛选产纤维素酶的优良菌株并实现纤维素的有效利用具有重要意义.利用纤维素酶降解纤维素是绿色、高效和可持续的利用方式,广泛应用于工业和农业领域(养殖、能源、纺织等).因此,实现高效低成本的纤维素酶生产成为研究和发展的目标.木霉属真菌是重要的纤维素酶产生菌,具有产酶量大、酶系全和酶活性高等优点,分泌的胞外酶易于工业生产中的分离提纯.本研究以课题组前期积累和保存的25种木霉150个菌株为材料,通过刚果红平板法筛选、滤纸酶活测定和天然纤维素降解等测试,筛选出 14 株产纤维素酶能力较强的菌株(优于对照菌株里氏木霉QM9414),从中选取 3 株进行最佳产酶条件探索,如接种量、吐温80添加量、发酵培养基pH值等.初步测试结果表明,贵州木霉菌株8705在20℃条件下、摇瓶发酵9 d、在优化后的发酵培养基中产酶效果最佳,其上清液酶活可达到6.63 IU/mL.通过优化发酵温度、发酵时间和培养基成分配比等发酵条件,为资源利用打下物质基础并提供理论依据.

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平.方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S.viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究.结果 S.viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为:以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min.以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3％,其中,阿维拉霉素A占组分含量81％,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4％,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定.另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4％.结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力.

[背景]由灰葡萄孢侵染所致的番茄灰霉病是一类重要的真菌病害,生物防治具有环境友好、病原菌不易产生抗药性等特点,是果蔬灰霉病绿色防控的有效措施.[目的]筛选对番茄灰霉病具有防病作用且能促进番茄种子发芽的广谱拮抗性链霉菌,并明确该菌株种级分类地位.[方法]采用琼脂块法筛选拮抗番茄灰霉病菌的链霉菌菌株,采用对峙培养法和生长速率法检测菌株T22抑菌谱,通过产胞外酶活性检测、离体叶片防效和种子发芽试验明确该菌株的防病促生相关特性,根据形态学特征、生理生化特性和分子生物学方法对该菌株进行种类鉴定.[结果]从分离的56株放线菌中筛选到14株对番茄灰霉病菌具有拮抗效果的放线菌菌株,其中链霉菌T22对番茄灰霉病菌抑制作用最强,且具有较广抑菌谱,同时菌株T22具有产生纤维素酶和几丁质酶的能力.菌株T22无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌抑菌率分别为84.6％、81.5％和79.1％;其无菌发酵滤液原液对番茄灰霉病离体防效为55.1％;100倍稀释液处理番茄种子,胚轴、胚根和种子活力指数分别增加15.1％、29.7％和43.9％.根据形态学特征、生理生化特性和多基因聚类分析将链霉菌T22鉴定为白黑链霉菌(Streptomyces alboniger).[结论]白黑链霉菌T22具有较强的抗真菌、产胞外酶、防病和促生活性,在番茄灰霉病生物防治中具有较好的开发应用潜力.

[背景]生物产生的天然色素在工业、农业和纺织工业上有潜在应用价值.[目的]通过对产色素海洋放线菌的分离与筛选,为开发细菌所产生的天然色素在纺织与食品工业中的应用奠定基础.[方法]筛选胞外产可溶性色素的放线菌,并通过16SrRNA基因序列测定和分析构建其系统发育树,并对影响色素产量的因素和色素稳定性进行实验.[结果]获得了一株产蓝色色素的放线菌Q2N-42和一株产黄绿色色素的放线菌X4C-5,16S rRNA基因序列分析表明它们分别与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)和普拉滕斯链霉菌(Streptomyces pratensis)的16S rRNA基因序列存在较高的相似性.通过研究不同碳源和氮源对放线菌Q2N-42和X4C-5产色素的影响,发现甘油和硝酸钠能明显地增加天蓝色链霉菌(S.coelicolor)Q2N-42的色素产量,而淀粉和硝酸钠能明显地增加普拉滕斯链霉菌(S.pratensis)X4C-5的色素产量.这两种色素对不同浓度的氧化剂、还原剂、盐和pH都表现出良好的稳定性;色素的红外光谱测定表明,其结构分别包含了-OH、-CH3和C=C基团.通过色素和不同媒染剂对棉线染色,发现硫酸铜是蓝色色素良好的媒染剂,毛线着色较深,洗涤不易脱色;而硫酸亚铁是绿色色素良好的媒染剂,毛线着色较深、有光泽,洗涤不易脱色.[结论]放线菌株Q2N-42和X4C-5所产生的色素为其工业应用提供了潜在的天然色素资源.

阿维拉霉素是由绿色产色链霉菌生产的寡糖类抗生素,对革兰氏阳性致病菌具有极强抗性,是一种新型饲料添加剂,广泛应用于肉鸡、仔猪等畜禽养殖中.以阿维拉霉素最新国内外研究进展为基础,综述了阿维拉霉素的抑菌机制、结构改造、菌种选育及发酵优化等方面的研究进展,重点阐述了阿维拉霉素的生物合成基因簇、合成途径及生物合成转录调控机制,探讨了提高阿维拉霉素产量的基因工程改造策略,为阿维拉霉素高效合成及工业化高产工程菌株构建等相关研究提供一定的理论参考.

[目的]套索肽作为一类核糖体翻译后修饰肽(RiPPs)广泛分布于放线菌中,以其独特的修饰结构和多样的生理活性受到了广泛的关注.为了更好地研究未知的套索肽,期望开发基于链霉菌的无细胞转录翻译平台(下称"无细胞平台")实现无细胞合成套索肽或其前体肽.[方法]首先尝试以不同的链霉菌构建无细胞合成平台,并以绿色荧光蛋白为报告蛋白对平台产率进行优化;在构建合适稳定的表达体系后,将包含有套索肽生物合成基因的质粒引入体系中以探索套索肽的无细胞合成.[结果]在对基于模式菌株Streptomyces lividans TK24的无细胞体系进行制备工艺、体系组分、反应条件等多个参数进行优化后,该体系最高能达到90 μg/mL的荧光蛋白表达量;基于该体系成功表达了目标套索肽的前体肽,并通过融合SUMO标签增加前体肽在该体系中的稳定性.[结论]本研究成功构建了一类链霉菌无细胞平台,为丰富来源的基因表达提供了可能性.尽管该体系在对表达套索肽未知蛋白的适用性上仍有待进一步提升,但无细胞平台在天然产物的探索中将起到越来越重要的作用.

[目的]为保证农业生产可持续性发展,研发和使用环境友好的生物农药受到全社会的高度重视.微生物代谢产物农药是我国目前应用最广的生物农药,也是未来发展绿色农药的一个重要方向.[方法]利用包含水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A的NA培养基琼脂平板,从水稻根际土壤中筛选能抑制Xoo 生长的链霉菌.通过高效液相色谱和质谱分析活性代谢产物的化学结构;采用剪叶法接种Xoo到水稻叶片后,再喷施杀粉蝶菌素溶液(0.1 g/L),2周后测定叶枯症状;采用响应面分析法优化高产杀粉蝶菌素的发酵培养基;采用PacBioSMRT测序平台+Illumina HiSeq X Ten平台开展全基因组测序.平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)用于比较HSW2009与其他链霉菌在全基因组水平的亲缘关系.[结果]分离到一株对Xoo生长有强抑制活性的链霉菌HSW2009,其活性代谢产物为杀粉蝶菌素Al(piericidin Al,简称PIE);喷施PIE可以减轻Xoo在水稻叶片内的侵染;优化HSW2009高产PIE的发酵条件,得到MFM培养基;HSW2009在MFM培养中生长快、PIE发酵效价最高可以达到0.72 g/L;菌落表型分析、PIE生物合成基因簇分析、全基因组测序和ANI分析表明HSW2009与目前有效描述的PIE产生菌不同.[结论]HSW2009是一株高产杀粉蝶菌素Al的链霉菌属候选新种,命名为绍武链霉菌,可作为杀粉蝶菌素产业化研究的出发菌株.

[目的]考察并建立高效、快速发酵中药渣制备有机肥的生产技术工艺,确定合适的发酵条件.[方法]采用间歇动态好氧发酵方法,以温度、有机质、氮、磷及钾为质量评价指标,单因素考察含水量、碳氮比、翻堆频率及适宜菌剂,筛选出最优发酵条件及最佳复合菌剂组合;设计正交实验,基于纤维素与木质素含量变化,确定最佳的中药渣发酵生产技术工艺.[结果]筛选出 3 种适宜有机肥发酵剂为细黄链霉菌、黑曲霉、地衣芽孢杆菌,确定最佳中药渣高效降解复合菌种组配比为细黄链霉菌∶细菌(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)∶真菌(黑曲霉、绿色木霉)=1∶2∶2,制备周期为 35 d,最优发酵生产技术工艺为初始含水量 50%,碳氮比为 35∶1,翻堆频率为 10 d/次,复合菌剂接种量为1.5%,中药渣中纤维素降解率可达到76.97%,木质素降解率达33.59%.研究结果表明,影响因素的主次顺序为翻堆频率>碳氮比>复合菌剂添加量>含水量.[结论]研究中堆肥参数工艺准确可靠,效率高,有效提高中药渣的降解率,可进一步尝试扩大生产推广运用.