目的:分析马钱子总碱的有效成分,观察马钱子总碱治疗家兔膝关节软骨损伤的作用机制.方法:采用醇提取-有机溶剂萃取法制备马钱子总碱.通过高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术分析马钱子总碱的有效成分.从36 只家兔中随机选取6 只作为假手术组,其余家兔建立膝关节软骨损伤模型.将造模成功的家兔随机分为模型组、马钱子总碱高剂量组(24 mg·kg-1)、中剂量组(12 mg·kg-1)、低剂量组(6mg·kg-1)及氟比洛芬组(37.5 mg·kg-1),每组 6只,每天给药1 次,连续2 周.采用高频X射线机观察膝关节形态,根据家兔运动情况进行疼痛评分.HE染色观察膝关节软骨的病理形态,ELISA法检测关节冲洗液中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量.结果:马钱子总碱的有效成分包括马钱子碱、士的宁、伪马钱子碱、马钱子碱氮氧化物、士的宁氮氧化物、依卡精及番木鳖次碱等.与假手术组比较,模型组家兔的膝关节X线K-L评分升高(P<0.01);与模型组比较,马钱子总碱低剂量、高剂量组及氟比洛芬组家兔的膝关节X线K-L评分降低(P<0.01).与假手术组比较,模型组家兔的疼痛评分、膝关节软骨Pelletier评分升高(P<0.05);与模型组比较,马钱子总碱各个剂量组家兔的疼痛评分、膝关节软骨Pelletier评分降低(P<0.05).HE染色显示,模型组家兔膝关节滑膜细胞增生,软骨层破坏.马钱子总碱各个剂量组和氟比洛芬组家兔膝关节软骨组织未见明显滑膜或软骨下骨病变.与假手术组比较,模型组家兔关节冲洗液中TNF-α、PGE2、IL-6 含量升高(P<0.01);与模型组比较,马钱子总碱高剂量组家兔关节冲洗液中TNF-α、PGE2 含量降低(P<0.05).结论:马钱子总碱可能通过马钱子碱、士的宁等有效成分,调控膝关节炎症因子水平,从而发挥改善膝关节软骨损伤的作用.

目的 采用G蛋白偶联受体及酶活检测实验方法,探究痹祺胶囊对类风湿性关节炎关键靶点的调节作用,明确其作用机制.方法 选取与抑制滑膜炎症相关的靶点[环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、核因子-κB(nuclear factor-KB,NF-κB)、趋化因子受体 4(C-C chemokine receptor type 4,CCR4)],与抑制血管翳生成相关的靶点[血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growth factorreceptor2,VEGFR2/KDR)],与抑制基质降解相关的受体[基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase-3,MMP-3)],以及与活血相关的靶点[凝血酶、磷酸二酯酶(cGMP-inhibited 3',5'-cyclic phosphodiesterase,PDE3A)、肾上腺素受体 α1(alpha-1A adrenergic receptor,ADRA1A)]为研究载体,通过胞内钙离子荧光和酶抑制剂检测技术评价痹祺胶囊中19个主要单体成分对受体的拮抗作用以及对酶的抑制活性.结果 19个化合物中,士的宁、党参炔苷、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、人参皂苷Rb1、阿魏酸、藁本内酯、牛膝皂苷D可显著抑制COX-2活性;马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、蜕皮甾酮、甘草苷可显著抑制NOS活性;丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B对NF-κB有较好拮抗作用;藁本内酯、牛膝皂苷Ⅳ、甘草次酸可拮抗CCR4;茯苓酸、牛膝皂苷Ⅳ、丹酚酸B、藁本内酯、甘草次酸能抑制VEGFR2/KDR;党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸、藁本内酯可抑制MMP-3活性;丹参素、丹参酮ⅡA、阿魏酸可抑制凝血酶活性,迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、甘草苷可抑制PDE3A活性;马钱子碱、士的宁、藁本内酯、牛膝皂苷Ⅳ、甘草次酸可拮抗ADRA1A.结论 痹祺胶囊可能通过干预COX-2、NOS、NF-κB、CCR4、VEGFR2/KDR、MMP-3、凝血酶、PDE3A及ADRA1A等关键靶点,发挥抗炎止痛、抑制血管翳形成及基质降解、活血作用,进而起到治疗类风湿性关节炎的药效作用.其药效物质基础可能为马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、迷迭香酸、阿魏酸、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、蜕皮甾酮、牛膝皂苷D、甘草次酸、甘草苷.

目的 探究痹祺胶囊祛风除湿、活血止痛功能的药效物质基础.方法 通过建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7体外炎症模型、细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor,M-CSF)与 RAW264.7 细胞共培养建立破骨细胞分化模型、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RA-HFLS增殖模型,分别探讨痹祺胶囊发挥抗炎活性、抑制破骨细胞形成、抑制RA-HFLS细胞增殖的作用机制及药效物质基础.MTS法检测细胞增殖活性,ELISA法检测细胞上清中一氧化氮(nitric oxide,NO)、TNF-α和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量,TRAP染色法检测破骨细胞分化数量,流式细胞术检测细胞凋亡情况,RT-qPCR法检测细胞中组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、RANKL mRNA相对表达情况.结果 痹祺胶囊及其19个单体成分均能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内NO、TNF-α和IL-6的释放,推测19个化合物是痹祺胶囊发挥抗炎作用的药效物质基础.痹祺胶囊及其13个单体成分均能显著减少RANKL和M-CSF诱导RAW264.7分化为破骨细胞的数量,并能明显降低破骨细胞标志基因CTSK和TRAP的相对表达量,推测马钱子碱、士的宁、党参炔苷、茯苓酸、丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、甘草次酸和甘草苷为痹祺胶囊发挥治疗骨破坏、缓解关节疼痛作用的主要物质基础.痹祺胶囊及其9个单体成分能明显抑制TNF-α诱导的RA-HFLS细胞增殖,并且能显著促进RA-HFLS细胞的凋亡以及明显降低MMP-3和RANKL基因的相对表达量,推测马钱子碱、士的宁、丹参素、丹参酮ⅡA、阿魏酸、藁本内酯、蜕皮甾酮、次黄嘌呤、甘草次酸为痹祺胶囊中发挥抑制滑膜增生作用的药效物质基础.结论 通过体外细胞实验初步确定马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、阿魏酸、藁本内酯、蜕皮甾酮、牛膝皂苷D、次黄嘌呤、甘草次酸、甘草苷为痹祺胶囊主要药效物质基础.

目的 建立痹祺胶囊的HPLC指纹图谱及甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量测定方法,更为全面地评价痹祺胶囊的质量.方法 采用Shiseido Capcell PakC18MG Ⅱ色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),指纹图谱以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,检测波长203 nm,柱温为35 ℃,测定19批痹祺胶囊指纹图谱,结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行全面分析;含量测定以乙腈-水-0.1％磷酸水溶液(21∶79∶0.1)为流动相;体积流量1.0mL/min;以二极管阵列检测器检测,甘草苷检测波长为276 nm,阿魏酸检测波长为321 nm,丹酚酸B检测波长为286 nm;柱温为40 ℃;进样体积均为10μL.结果 19批痹祺胶囊指纹图谱相似度大于0.97,共标定了 36个共有峰,确认了 6号峰为丹参素、10号峰为士的宁、11号峰为马钱子碱、13号峰为甘草苷、14号峰为阿魏酸、15号峰为迷迭香酸、16号峰为人参皂苷Rg1、18号峰为丹酚酸B、20号峰为人参皂苷Rb1、22号峰为甘草酸铵、27号峰为藁本内酯、30号峰为丹参酮ⅡA、33号峰为茯苓酸13个成分;含量测定中甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B进样量在30.35～455.30 ng、5.046～75.690 ng、61.79～926.90 ng线性关系良好(均为r=0.999 9);平均回收率在98.43％～102.12％,RSD均＜2％;19批痹祺胶囊中甘草苷质量分数在0.630～1.428 mg/g,阿魏酸质量分数在0.188～0.260mg/g,丹酚酸B质量分数在2.539～3.442 mg/g.结论 建立的指纹图谱及含量测定方法适用于痹祺胶囊的全面质量评价.

目的 提升接骨丹片的质量标准.方法 采用薄层色谱法鉴别制剂中的制马钱子和大黄;采用高效液相色谱法同时测定马钱子碱和士的宁的含量,色谱柱为Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 cm,5μm),流动相为乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸钠与 0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液进行梯度洗脱,流速为 1.0 mL/min,检测波长为 260 nm,柱温为 30℃,进样量为 10μL.结果 制马钱子、大黄的薄层色谱图斑点清晰,分离度高,且阴性对照无干扰.马钱子碱和士的宁的质量浓度分别在 1.46～116.73μg/mL和 1.60～128.30μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r = 0.999 5,0.999 7,n = 6);精密度、重复性、稳定性试验结果的RSD均小于 2.0%(n = 6);平均加样回收率分别为 97.28%和 96.23%,RSD分别为 1.16%和 1.36%(n = 6).结论 该方法专属性好,结果准确、可靠,可用于接骨丹片的质量评价.

目的 探讨马钱子碱和士的宁通过阻断hERG通道发挥抗肿瘤作用.方法 采用脂质体转染及选择性培养基构建hERG转染CHO细胞和载体转染CHO细胞的稳定细胞株;CCK-8检测共培养24、48、72 h后马钱子碱及其结构类似物对癌细胞增殖的影响,以及共培养48 h后马钱子碱及其结构类似物对hERG-CHO细胞增殖的影响,以载体转染CHO细胞作为对照;流式细胞术检测马HT29、A549细胞周期;免疫印迹法检测HT29、PC9、A549细胞中hERG蛋白表达.结果 马钱子碱和士的宁呈时间和浓度依赖性抑制HT29、PC9、A549细胞增殖,这种抗增殖作用与癌细胞中hERG蛋白表达正相关;而马钱子碱和士的宁的氮氧化物仅在高浓度对hERG通道有较弱的阻断活性,对肿瘤细胞也仅在高浓度表现出较弱的增殖抑制作用.马钱子碱对稳定表达hERG的CHO细胞的增殖抑制作用显著高于载体转染的CHO细胞.马钱子碱和士的宁将HT29细胞周期阻滞于G0/G1期,对A549细胞周期没有明显影响.马钱子碱不影响癌细胞的hERG蛋白表达.结论 马钱子碱和士的宁对癌细胞的增殖抑制作用可能与hERG通道阻断相关,该研究将为hERG通道阻断剂在肿瘤治疗方面的应用提供重要的指导和依据.

目的 对三色散凝胶贴膏原料药的提取工艺进行优化.方法 将SD大鼠分为空白组、模型组、传统工艺组、水提组和醇提组,每组5只,采用前交叉韧带横断术建立膝骨关节炎模型,考察不同提取方式所得凝胶贴膏对膝骨关节炎大鼠的药效学影响.分别以冷、热痛阈值与疼痛介质降钙素基因相关肽(CGRP)、环氧合酶2(COX-2)、P物质(SP)、前列腺素E2(PGE2)含量为指标进行镇痛实验;对大鼠滑膜组织进行HE染色,观察大鼠滑膜细胞增殖、炎症细胞浸润、血管入侵程度,并以白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6蛋白与mRNA表达水平为指标进行抗炎实验,对比各组大鼠的抗炎镇痛效果差异.以加醇倍数、提取时间、提取次数作为正交试验考察因素,以蔓荆子黄素、士的宁和马钱子碱含量为评价指标并计算综合评分,优选出三色散凝胶贴膏原料药的提取工艺并进行验证实验.结果 与模型组比较,各给药组大鼠的冷痛阈值和热痛阈值(除传统工艺组外)均显著升高(P＜0.05),疼痛介质CGRP、COX-2、SP、PGE2含量均显著下降(P＜0.05);滑膜组织炎症细胞浸润减少、纤维化程度减轻,胶原沉积减少,可见少量毛细血管增生;滑膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白与mRNA表达水平均显著降低(P＜0.05).与传统工艺组比较,醇提组大鼠的大部分检测指标显著降低(P＜0.05),而水提组大鼠仅热痛阈值和滑膜组织中IL-6 mRNA表达水平显著降低(P＜0.05).三色散凝胶贴膏原料药的最佳提取工艺为取适量三色散细粉,加8倍量55%乙醇,加热回流提取90 min,提取2次;3次验证实验结果显示,蔓荆子黄素、士的宁与马钱子碱含量平均值分别为0.007%、0.092%、0.214%,RSD均小于5%.结论 优化的三色散凝胶贴膏原料药提取工艺稳定、可行,有利于提高该制剂药效.

目的 优选绿豆煮马钱子的加压炮制工艺.方法 采用最小二乘法建立炮制时间、炮制压力、绿豆用量和加水量4个因素对士的宁、马钱子碱含量的一元模型函数,通过对一元模型函数进行分析提出多元模型假设;基于正交实验,利用遗传算法对模型中的未定系数进行求解,构建基于士的宁、马钱子碱含量的双目标优化模型,求解模型函数得到最佳工艺,并对其进行验证.结果 最佳炮制工艺为:马钱子与绿豆在2.393 MPa饱和蒸汽压力下煮5.5 h,捞出;冲洗除去绿豆,并刮去马钱子皮毛,切顶刀片0.6 mm厚;每500 g马钱子用绿豆180 g、水15 L.结论 优化后的加压炮制工艺稳定、可行,可为绿豆煮马钱子炮制工艺优化提供参考.

某些藏药植物药中的活性成分同时也是毒性成分,需要在使用中确切了解其作用机制及代谢途径.毒性较大的藏药植物药,其内源性毒性成分主要为生物碱,如乌头类、甲基牛扁碱等二萜生物碱、莨菪烷类生物碱、马钱子碱、士的宁、罂粟碱和苦马豆素等.藏药植物药中具有代表性的内源性生物碱类毒性成分多存在于根、种子和果实中,多因其剧毒或高毒化学物本质,表现出神经毒性和心脏毒性.一般经去烷基、羟基化和水解等Ⅰ相代谢过程及与葡萄糖醛酸、磺酸结合等Ⅱ相代谢过程,产生多种高极性和毒性减弱的代谢产物,排出体外.多种生物碱的中毒剂量与治疗剂量相近,藏药典籍中常采用炒制、奶制、青稞酒制和诃子配伍等减毒后入药.本文针对包括乌头类二萜双酯、莨菪烷和马钱子碱等在内的5类12种生物碱,着重评述其代谢转化、减毒和安全性评价特点,以期为制定藏药植物药内源性毒性成分限量、临床用药和减毒治疗提供全面参考.

目的 以相态角度为出发点,研究马钱子-甘草配伍减毒的作用规律.方法 采用自然沉降法、高速离心法及层级透析技术对马钱子单煎液、马钱子-甘草配伍共煎液进行相态拆分研究;建立毒效物质UPLC-MS测定法,对比研究4个不同相态中马钱子碱和士的宁量分布的差异,分析毒效物质量的变化规律.结果 配伍汤液可拆分为真溶液组、胶体溶液组、混悬液组及沉积物组4个不同相态;在选定的色谱条件下马钱子碱和士的宁均得到良好分离,分别在0.020～2.008、0.022～2.236μg线性关系良好(r均为0.999 8),回收率为96.84％、97.62％,表明方法学良好;测定单煎液不同相态中马钱子碱和士的宁量的分布呈现相同变化规律,即胶体组＞溶液组＞沉积物组＞混悬组,配伍汤液不同相态马钱子碱和士的宁也同样呈现相同的分布规律,即沉积物组＞胶体组＞混悬组＞溶液组.结论 马钱子经甘草配伍后其毒效物质的量均有降低,毒性最强的士的宁的量降低尤为明显,且主要集中在沉积物组分:不同相态中毒效物质变化规律的研究表明,配伍甘草后的沉积物组分的缓释作用,是实现减毒增效关键因素.