目的:探讨骆驼蓬总碱(TAH)能否诱导神经细胞自噬并促进神经毒性蛋白Tau蛋白和α-突触核蛋白(α-Syn)的降解。方法:(1)将体外培养的PC12细胞分为空白对照组及1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH组，分别加入0、1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH作用24 h，观察细胞形态及数目的变化，采用MTT法检测细胞存活率；(2)将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬激活剂雷帕霉素及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH作用4 h，采用免疫荧光染色检测细胞自噬体数；(3)将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组、10 μg/mL TAH组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L雷帕霉素、10 μg/mL TAH作用4 h，Western blotting检测细胞p62和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白的表达；(4)将PC12细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬抑制剂氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用4 h，Western blotting检测细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达；(5)将PC12细胞分为TAH组和空白对照组，分别加入10 μg/mL TAH和等量溶剂处理4 h后，Western blotting检测细胞磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶(p-p70S6K)的表达；(6)将过表达Tau-绿色荧光蛋白(GFP)的Tet on HEK293细胞分为空白对照组、TAH组、强力霉素组、强力霉素+TAH组、强力霉素+TAH+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、强力霉素+TAH+氯喹组，后4组细胞加入200 ng/mL强力霉素处理24 h后，空白对照组加入等量溶剂，TAH组加入10 μg/mL TAH，后3组细胞分别加入10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+5 mmol/L 3-MA、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹，作用24 h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞绿色荧光强度的变化，Western blotting检测细胞Tau-GFP和LC3-Ⅱ蛋白的表达；(7)将稳定表达α-Syn的HEK293细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组，分别加入等量溶剂、50 nmol/L氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用24 h，Western blotting检测细胞α-Syn和LC3-Ⅱ蛋白的表达。结果:(1)与空白对照组比较，20、50 μg/mL TAH组细胞存活率降低，且50 μg/mL TAH组细胞存活率低于20 μg/mL TAH组，差异均有统计学意义( P<0.05)；(2)与空白对照组比较，雷帕霉素组、10、20 μg/mL TAH组细胞自噬体数增多，且10 μg/mL TAH组细胞自噬体数多于20 μg/mL TAH组，差异均有统计学意义( P<0.05)，因此，选择10 μg/mL TAH用于后续实验；(3)与空白对照组比较，雷帕霉素组、TAH组细胞p62蛋白的表达均降低，LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加，差异均有统计学意义( P<0.05)；(4)与空白对照组比较，氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加，且TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达高于氯喹组，差异均有统计学意义( P<0.05)；(5)与空白对照组比较，TAH组细胞p-mTOR、p-p70S6K的表达均降低，差异均有统计学意义( P<0.05)；(6)强力霉素组细胞Tau-GFP蛋白的表达较空白对照组增加，强力霉素+TAH组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素组降低，强力霉素+TAH+3-MA组、强力霉素+TAH+氯喹组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高，差异均有统计学意义( P<0.05)。TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较空白对照组增加，强力霉素+TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素组增加，强力霉素+TAH+3-MA组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组降低，强力霉素+TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高，差异均有统计学意义( P<0.05)；(7)与空白对照组比较，TAH组HEK293细胞α-Syn蛋白的表达降低，LC3-Ⅱ蛋白的表达升高，差异均有统计学意义( P<0.05)；TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达高于氯喹组，TAH+氯喹组细胞α-Syn蛋白的表达高于TAH组，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:TAH可能通过抑制mTOR/p70S6K信号通路激活神经细胞自噬，从而促进Tau和α-Syn的降解。

目的 研究骆驼蓬Peganum harmala子醇提液酸溶碱沉后总生物碱的化学成分.方法 采用多种色谱技术进行分离纯化,通过MS、NMR及合成等方法对化合物结构进行鉴定,并以CCK-8法测定部分化合物对人结肠癌HCT116细胞的体外抗肿瘤活性.结果 从骆驼蓬子总生物碱中分离得到了 12个化合物,分别为1.甲基-2-甲氧甲基-7-甲氧基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-盐酸盐(1)、对苯二甲酸二(2-乙基)己酯(2)、鸭嘴花酮碱(3)、鸭嘴花碱(4)、harmalanine(5)、去氢骆驼蓬碱(6)、哈尔满(7)、哈尔酚(8)、norharmane(9)、骆驼蓬碱(10)、四氢骆驼蓬碱(11)、骆驼蓬酚(12).体外抗肿瘤实验表明,化合物 5 的 24h 半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC50)为(36.41±1.91)μmol/L.结论 化合物 1 为新化合物,命名为氮杂缩醛去氢骆驼蓬碱A,化合物2为骆驼蓬植物中首次分离得到,而较强共轭系统的化合物5具有潜在的抗癌活性.

宫颈癌是严重威胁女性身体健康的常见恶性肿瘤.现代医学常采用手术、放疗、化疗等治疗方法,取得较好的临床疗效,但肿瘤复发和转移仍然是宫颈癌患者死亡的主要原因.中医药发展历史悠久,中药复方、中成药、中药注射液等在肿瘤治疗中疗效显著.中药单体是源自于中药的有效提取物,在抗肿瘤方面发挥着重要作用.其中黄芩素、茯苓酸等可以通过抑制分泌型糖蛋白/β-链蛋白(Wnt/β-catenin)通路活性抑制宫颈癌细胞生长;紫草素、青蒿素等抗肿瘤的作用机制与调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素哺乳靶蛋白(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3 K/Akt/mTOR)相关;姜黄素、人参皂苷等可以通过调控核转录因子-κB(p-nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信号通路抑制细胞增殖;牡荆素、白藜芦醇等可以上调p53蛋白表达发挥其抑癌作用;常春藤皂苷元、五味子乙素等可以抑制转录激活因子3(Recombinant signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路活性;柚皮素、半枝莲多糖可以上调腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)表达;而神经源性位点缺口同源蛋白(Notch)信号通路在宫颈癌发生中的作用机制具有争议.斑蝥素、黄芩素等中药单体可以调控丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路;土槿皮乙酸、去氢骆驼蓬碱可以抑制磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/糖原合酶激酶-3β(Phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase-3,PI3K/Akt/GSK-3β)信号通路;虫草素、桔梗皂苷-D具有调控Hippo信号的作用;黄芩素、白藜芦醇抗宫颈癌作用机制则与Hedgehog信号有关.目前,关于中药单体调控宫颈癌信号通路的研究众多,但缺乏系统总结.本研究通过总结中药单体调控宫颈癌相关信号通路,以期为中药单体在宫颈癌中的广泛应用提供指导,为中医药防治宫颈癌提供新的药物靶点.

目的:通过生物信息学方法探寻结直肠癌的诊断标志物及潜在的治疗靶点与治疗药物.方法:从美国国立生物技术信息中心(NCBI)公共数据平台基因表达大棚车(GEO)下载芯片数据GSE74602,包括60个样本,其中30例结直肠癌样本,30例正常结直肠组织样本.用R语言中的Limma包对正常组织和癌症组织进行差异表达分析,用DAVID在线数据库对筛选出来的差异表达基因进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科(KEGG)信号通路分析,同时通过STRING在线数据库构建差异表达基因的蛋白互作网络,利用Cytoscape软件进行可视化编辑,并且通过MCODE插件进行子网络模块分析,筛选出结直肠癌发生过程中的核心基因.最后,用连通图数据库(cMap)分析具有潜在治疗结直肠癌的小分子药物.结果:总共筛选出231个差异表达基因,包括122个上调基因,109个下调基因.GO分析结果表明,表达上调的基因富集的生物学过程主要包括细胞周期、细胞分裂等,而表达下调的基因富集在免疫反应,细胞内信号级联和防御反应等生物学过程.KEGG通路分析发现表达上调的基因主要参与细胞中氮及矿物质的代谢和细胞中相关物质的分泌(胆汁、胰液)的信号通路,而表达下调的基因主要参与药物代谢、细胞循环以及p53信号传导通路.子网络模块分析发现了一些在结直肠癌发生的调控中起着重要作用的关键基因,如KIF20A、CENPF、NCAPG、PYY、IQGAP3;蛋白互作网络中的差异表达基因被映射到cMap上,筛选出若干个潜在治疗结直肠癌的小分子药物,如紫霉素、去甲骆驼蓬碱、斑鸠霉素等.结论:所发现的关键基因可能会成为诊断结直肠癌新的肿瘤标志物或者治疗结直肠癌的新的靶点;此外,筛选出的小分子药物有可能成为治疗结直肠癌的新型药物.

目的:建立哈萨克药骆驼蓬草药材的质量标准.方法:以新疆哈萨克地区采集的10批骆驼蓬草药材为研究对象,考察其性状;采用薄层色谱(TLC)法对药材中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱进行定性鉴别;采用2015版《中国药典》(四部)相关方法检查其水分、总灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物含量;采用高效液相色谱(HPLC)法测定药材中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的含量,色谱柱为X-bridge C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-醋酸铵缓冲液(冰醋酸调节pH至6),梯度洗脱,检测波长为267 nm,柱温为25℃,流速为1 mL/min,进样量为5μL.结果:TLC法鉴别结果显示,10批药材在骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱对照品相同位置处均显示清晰斑点;水分、总灰分、酸不溶性灰分分别不得高于12％、22％、2％,醇浸出物不得低于16％.HPLC法考察结果显示,骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱分别在15.22～301.40、15.09～301.80μg/mL质量浓度范围内线性关系良好,精密度、重复性、稳定性试验的RSD均小于4％,平均回收率分别为100.22％、100.94％(RSD均小于2％);含量测定结果显示,该药材总生物碱含量(以骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱合计)不得少于6.5 mg/g.结论:本研究在原标准基础上增加了检查项,建立了TLC法鉴别骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬和HPLC法测定两者含量的方法.所建质量标准可用于全面控制新疆哈萨克地区骆驼蓬草药材的质量.

目的 研究骆驼蓬总碱(total alkaloid of harmaline,TAH)通过调节神经细胞自噬促进Tau蛋白的降解作用.方法 完全培养基培养稳定表达绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(green fluo-rescent protein-microtubule associated protein 1 light chain 3,GFP-LC3)的大鼠肾(normal rat kidney,NRK)细胞、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),分成对照组(CT组)、雷帕霉素(rapamycin,Rapa)组和TAH组,利用激光共聚焦显微镜观察自噬体数量的变化,蛋白免疫印迹技术检测自噬底物蛋白(p62/sequestosome-1,P62/SQSTM1)和自噬体标志性蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)LC3-II蛋白表达水平的变化;完全培养基培养表达Tau-绿色荧光蛋白(tau-green fluorescent protein,Tau-GFP)的人胚肾-293(human embryonic kidney-293,HEK-293)细胞,分成对照组(CT组)、模型组(DOX组)和药物组(DOX+TAH组),结合溶酶体标记探针Lyso-track-er Red,利用激光共聚焦显微镜观察Tau-GFP的荧光变化及溶酶体活性的变化,蛋白免疫印迹技术检测Tau-GFP和LC3-II蛋白表达水平的变化.结果 与CT组比较,TAH组细胞中自噬体数目增多,P62蛋白表达水平降低,LC3-II蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);DOX诱导Tau蛋白表达后,与DOX组比较,DOX+TAH组Tau-GFP荧光强度减弱,蛋白表达水平降低,LC3-II蛋白表达水平升高,溶酶体活性增强,差异有统计学意义(P<0.05).结论 TAH可以降解Tau蛋白,并通过诱导神经细胞自噬发挥此作用.

目的 探讨去氢骆驼蓬碱Harmine (HM)对小鼠肝细胞NCTC1469和神经细胞PC12增殖与凋亡的影响,为去氢骆驼蓬碱衍生物作为抗包虫病候选药物的研发提供参考. 方法 体外培养的小鼠肝细胞NCTC1469和神经细胞PC12分为HM干预组和无药物组对照组,用噻唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度HM作用不同时间对细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜下观察药物作用后的细胞形态改变;采用Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡的形态学变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况. 结果 MTT检测去氢骆驼蓬碱可抑制PC12和NCTC1469和细胞的增殖,该抑制作用呈时间一浓度依赖(F值分别为126.43、125.32、145.82,P＜0.01;F值分别为147.95、222.67、242.28,P＜0.01).HM处理PC12细胞24、48、72 h的IC50分别为32.40、24.50和15.37 μg/ml,HM处理PC12细胞24、48、72 h对NCTC1469细胞的IC50分别为62.19、38.43和28.52μtg/ml.对照组细胞贴壁生长,排列均匀,大小基本一致,轮廓清晰,悬浮细胞少;实验组随着去氢骆驼蓬碱浓度的升高,细胞出现皱缩,细胞数量及生长密度逐渐减少.Hoeehst33258染色观察去氢骆驼蓬碱干预24 h后细胞核均出现不同程度蓝色荧光,可见核致密、浓染等典型的细胞凋亡特征.10、20、40 μg/ml去氢骆驼蓬碱干预24 h,PC 12细胞总凋亡率分别为(12.52士2.21)％、(23.44土1.27)和(55.85±2.30)％,NCTC1469细胞总凋亡率分别为(15.20土2.67)％、(41.31土3.09)和(53.92±2.58)％,与对照组比较差异均有统计学意义(t值分别为-27.42、-48.73、-93.76,P＜0.01;t值分别为-76.00、-116.67、-144.25,P＜0.01). 结论 去氢骆驼蓬碱能抑制PC12、NCTC1469细胞增殖,促进细胞凋亡,且存在正向的剂量-效应关系.

目的 探讨1-(4-甲氧基)苯基-9-丁基-β-咔啉(DH-004)对秀丽隐杆线虫(简称线虫)的神经毒性.方法 采用野生型线虫为模式生物,分别以DH-0040.0(溶剂对照组),12.5,25.0,50.0,100.0和200.0μmol·L-1连续培养,分别于不同时间显微镜下观察线虫的存活率、头部摆动频次、有效产卵总数、趋向和趋避行为及摄食行为.吖啶橙染色荧光显微镜下观察细胞凋亡;试剂盒检测虫体组织乙酰胆碱酯酶(AChE)活性.结果 与溶剂对照组相比,不同浓度DH-004染毒处理5 d后,线虫存活率随药物浓度的增加而显著降低(R 2=0.949,P<0.01).DH-00425.0μmol·L-1处理3 d(P<0.01)、50.0μmol·L-1处理1～3 d(P<0.05,P<0.01)及100.0和200.0μmol·L-1处理1～3 d(P<0.01)组线虫头部摆动频次均显著降低.与溶剂对照组相比,DH-00425.0,50.0,100.0和200.0μmol·L-1组有效虫卵总数明显减少(P<0.01),趋向系数显著下降(P<0.05,P<0.01),趋避系数显著上升(P<0.01);DH-00412.5μmol·L-1组处理2～3 d(P<0.01)及25.0,50.0,100.0和200.0μmol·L-1组处理1～3 d(P<0.01)线虫咽部收缩次数均显著减少.吖啶橙染色结果显示,与溶剂对照组相比,DH-00450.0,100.0和200.0μmol·L-1组细胞凋亡水平显著升高(P<0.01).与溶剂对照组相比,DH-004浓度依赖性增高线虫体内AChE活性抑制率(R 2=0.851,P<0.01),IC50为(94.7±3.7)μmol·L-1.结论 DH-004对线虫具有一定的神经毒性效应,其作用机制可能与促进细胞凋亡和抑制AChE活性有关.

目的 筛查"肝肾阴虚证"原发性骨质疏松症患者的血清小分子差异代谢物.方法 筛选门诊符合"肝肾阴虚"证型的患者.通过纳入排除标准,筛选出肝肾阴虚组(I组)、正常组(CK组)各30例.运用UPLC-MS技术检测两组受试者血清小分子代谢物,并进行差异分析,筛选肝肾阴虚证型的差异代谢物.结果 共鉴定出小分子代谢物6478个.初始筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的VIP>1,t检验的P<0.05.筛选I-CK组差异代谢物418个.进一步筛选标准为:①VIP>1;②P<0.05;③log2(FC)>1或者<-1;④Fragment score■0.共筛选出15个肝肾阴虚证差异性代谢物(氨基酸类6个:甘氨胆酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、氨基吡唑基丙酸;生物碱类2个:茶碱,骆驼蓬总碱;胆红素类2个:胆红素、(4E,15Z)-胆红素;磷脂类1个:溶血磷脂酰乙醇胺;恶唑类1个:2-甲基-4-戊氯恶唑;酚酯类1个:二苯氧苯胺;低聚肽类1个:乳基谷胱甘肽;二萜类1个:15-O DC.结论 筛选出骨质疏松症阴虚证的潜在临床代谢标志物,可用于下一步代谢通路研究.提示代谢组学技术在探索传统中医理论本质及中医药临床研究方面,具有较为广泛的应用前景.