目的：:观察糖皮质激素代谢酶11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-HSD1）在不同年龄Sprague-Dawlay （SD）大鼠眼内的表达与分布。方法：:实验研究。将SD大鼠按年龄分为6组：1~2日龄新生组（PND1）、5~6日龄组（PND5）、10~11日龄组（PND10）、14~15日龄刚开眼组（PND15）、20~21日龄组（PND20）和8~9周龄成年组（M），每组6只。采用免疫组织化学染色法（IHC）检测从新生、开眼到成年等不同发育阶段SD大鼠眼组织内11β-HSD1蛋白的表达和分布情况，并通过Real time RT-PCR和Western blot进一步验证11β-HSD1在不同年龄段大鼠视网膜内的表达差异。组间数据比较采用单因素方差分析或 t检验分析。 结果：:IHC显示11β-HSD1在各年龄组SD大鼠眼角膜、虹膜、视网膜、脉络膜、晶状体、睫状体等组织中均有表达，新生SD大鼠眼组织中的11β-HSD1阳性细胞数更多，染色更明显。Real time RT-PCR结果显示，角膜内 11β-HSD1 mRNA相对表达量在SD大鼠出生后10 d达到高峰，SD大鼠开眼后开始逐渐下降，差异有统计学意义（ F=8.40， P<0.001）。开眼前SD大鼠视网膜内的 11β-HSD1 mRNA相对表达量高于开眼后和成年，差异有统计学意义（ F=83.50， P<0.001）。Western bolt进一步证实，新生大鼠视网膜内的11β-HSD1蛋白表达量高于刚开眼大鼠和成年大鼠，差异有统计学意义（ t=4.76， P=0.009； t=4.24， P=0.013）。 结论：:11β-HSD1在SD大鼠眼组织内广泛分布，其表达量随年龄而变化，开眼前SD大鼠眼组织尚未分化发育成熟，其表达量较高，提示11β-HSD1可能与SD大鼠眼组织的分化、发育和成熟有关。

目的 建立小鼠1型糖尿病模型,研究糖尿病早期时睾丸中睾酮合成关键酶的变化.方法 雄性成年鼠20只,随机分为对照组10只、糖尿病模型组10只.通过ip链脲佐菌素(150 mg/kg)制备糖尿病模型,成功制备糖尿病模型后4周处死小鼠,取血清和睾丸组织备用.实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测睾丸组织中促黄体生成素受体(LHR)、类固醇激素合成灵敏调节蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氢酶Ⅵ型(3β-HSD6)、17a-羟基化酶/17,20-裂解酶Ⅰ型(P450c17a1)及17β-羟基类固醇脱氢酶Ⅲ型(17β-HSD3)相应mRNA(Lhcgr、Star、Cyp11a1、Hsd3b6、Cyp17a1和Hsd17b3)含量,酶联免疫吸附法测定血清中睾酮和黄体生成素(LH)含量、睾丸组织中3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3酶活性.结果 与对照组比较,4周糖尿病小鼠血清中睾酮和LH含量显著降低(P＜0.05);睾丸组织的Lhcgr、Star、Cyp11a1、Hsd3b6、Cyp17a1和Hsd17b3 mRNA含量显著降低(P＜0.05、0.001);3β-HSD1、P450c17及17β-HSD3酶活性显著降低(P＜0.05、0.01).结论 早期糖尿病小鼠睾丸中睾酮合成关键酶的表达显著降低.

目的:探讨Ⅰ型11β-羟基类固醇脱氢酶(11β-HSD1)对脂质蓄积的影响及机制.方法:构建Ⅰ型11β-羟基类固醇脱氢酶腺病毒(Ad-11β-HSD1),并在293A细胞中进行扩增和纯化;C57BL/6小鼠按随机数字表法分组,实验组10只,通过尾静脉注射Ad-11β-HSD1,对照组10只.2周后采集小鼠血浆,收集肝脏组织.油红O染色观察肝脏组织脂质蓄积情况;酶法测定血脂以及肝脏中脂质含量;利用实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析和蛋白免疫印迹,分析脂代谢相关基因和蛋白表达情况;分析AKT/GSK胰岛素信号通路的改变.结果:与对照组相比,2周后实验组肝脏脂质蓄积,脂滴富集明显,脂质定量显著增加[(59.61 ±3.21)vs.(80.47±5.1)μg/mg,P＜0.05];实验组脂肪酸合成通路主调控因子SREBP1及其合成通路相关蛋白FAS、SCD1和ACC1的表达水平均不同程度升高(P＜0.05),而基因表达水平无差异.胰岛素信号通路受损,p-AKT,p-GSK水平降低(P＜0.05).血浆中TG和TC水平无差异.结论:11β-HSD1可能通过损伤胰岛素信号通路,并激活脂肪酸合成通路而促进小鼠脂肪肝形成.

目的:构建人Ⅰ型11β羟基类固醇脘氢酶(11β-HSD1)原核表达载体并表达目的蛋白,为代谢综合征的研究奠定基础.方法:从HepG2细胞系中提取细胞总RNA,经反转录合成cDNA第一链后再以其为模版,扩增11β-HSD1基因.pET32a原核表达载体和PCR扩增出的产物经过Bam HI和XhoⅠ双酶切后,在16℃过夜的条件下用T4 DNA连接酶连接上述酶切产物,然后用该产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞,挑克隆后进行测序.将克隆成功的11β-HSD1重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),分别用不同浓度、不同时间的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖)诱导其表达,并优化诱导条件.表达的蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色的方法观察目的基因的表达情况.结果:挑选的克隆经测序证实pET32a-11β-HSD1重组质粒构建成功,11β-HSD1基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,在IPTG浓度为10μM,诱导时间为5小时时,上清中有明显的分子量约为52 kDa的重组蛋白产生,且目的蛋白分子量的大小与预期一致.结论:本实验成功构建了人pET32a-1 1β-HSD1蛋白原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功诱导了其融合表达.目的蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于上清中,为进一步研究其结构、功能、制备抗体等奠定了基础.

目的:本研究通过对肝脏特异性Ⅰ型11β-羟基类固醇脱氢酶(11β-HSD1)转基因小鼠进行表型分析,并对其肝脏组织进行RNA测序(RNA-seq),获得长链非编码RNA(lncRNA)和信使RNA(mRNA)表达谱,重点分析与脂质代谢相关的mRNA和lncRNA的差异表达基因.方法:构建肝脏特异性11β-HSD1转基因小鼠;收集野生型和肝脏特异性11β-HSD1转基因小鼠的肝脏组织;油红0染色观察肝脏组织脂质蓄积情况;酶法测定肝脏组织三酰甘油含量;利用蛋白免疫印迹检测脂代谢相关蛋白表达情况;提取两组小鼠肝脏RNA,通过RNA-seq构建mRNA和lncRNA差异表达谱;通过GO和KEGGPATHWAY分析对差异表达的基因进行生物学过程的富集和脂质代谢通路的分析,筛选出与脂代谢相关的差异显著的mRNA和lncRNA;通过实时荧光定量PCR验证肝脏组织中部分差异显著的与脂代谢相关的基因表达水平.结果:肝脏特异性11β-HSD1转基因小鼠相比野生型小鼠,肝脏高度表达11β-HSD1蛋白,模型构建成功.与野生型小鼠相比,肝脏特异性11β-HSD1转基因小鼠肝脏脂质蓄积,脂质合成通路激活.RNA-seq测序显示,两组样本中有323条差异表达的lncRNA和825条差异表达的mR-NA.其中123条lncRNA表达上调,200条lncRNA表达下调;表达上调和下调的mRNA数目分别为376和449.进一步对其进行GO富集分析,结果显示差异表达的RNA主要参与脂质代谢、脂质生物合成和脂肪酸代谢等生物学过程.实时荧光定量PCR验证部分基因表达水平的结果与RNA-seq测序一致.结论:本研究获取了全面的肝脏特异性11β-HSD1转基因小鼠转录组信息,加深了对肝脏特异性11β-HSD1转基因小鼠肝脏脂质蓄积的理解,为脂肪肝的防治提供理论依据.

目的:本文通过对肝脏特异性Ⅰ型11(-羟基类固醇脱氢酶(11β-HSD1)转基因小鼠进行表型分析,并进一步分析前期RNA测序数据,探究转基因小鼠表型成因及潜在机制.方法:构建肝特异性过表达11β-HSD1转基因小鼠,收集野生型及转基因小鼠的肝脏、附睾白色脂肪组织、肩胛骨棕色脂肪组织进行称重,对肝脏进行油红O染色及测定TG含量以确定肝脏组织脂质蓄积情况;利用代谢笼监测及冷刺激实验观察野生型及转基因小鼠能量代谢表型;进一步分析前期RNA测序数据,通过KEGG PATHWAY和GO分析对脂代谢相关通路差异表达基因进行分析,筛选出与脂质代谢密切相关的差异表达基因.结果:与野生型小鼠相比,肝特异性过表达11β-HSD1转基因小鼠的肝脏脂质蓄积,附睾白色脂肪组织重量增加,肩胛骨棕色脂肪组织重量减少,代谢笼数据表明转基因小鼠产热能力受损,能量消耗减少.RNA测序数据显示肝特异性过表达11β-HSD1使机体脂质代谢等生物学过程发生明显变化,脂质β氧化负调控因子甲基转移酶样蛋白20(Mettl20)发生明显上调.结论:本研究发现了肝特异性转基因小鼠一种新的能量代谢受损的表型,为肝脏特异性11 β-HSD1转基因小鼠肝脏发生脂质蓄积的机制提供了新的研究角度,为代谢障碍相关性脂肪肝病的治疗策略提供了新的研究思路.